全自动QuEChERS结合液相色谱串联质谱法测定蔬菜中16种磺胺类残留量

耿春辉，张嘉楠，王爱卿

（1.衡水市综合检验检测中心，河北 衡水 053000；2.秦皇岛市农产品质量安全检验监测中心，河北 秦皇岛 066000；3.沧州市农产品质量安全中心，河北 沧州 061000）

磺胺类抗生素（SAs）是一种人工合成的抗菌药，是对具有氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称［1］，常作为饲料添加剂预防动物疾病，但其进入动物体内的抗生素不能完全代谢，大部分以原型或代谢产物的形式随动物粪尿排出体外［2］，在环境中持续积累，形成了假性POPs 现象［3］。

畜禽粪便作为有机肥广泛应用于农业生产中［4］，使抗生素在植物内大量积累，并通过食物链对动物和人体产生毒害风险。由此可见，长期大量施用高抗生素残留的畜禽粪便已成为蔬菜生产中的不安全因素，研究蔬菜中抗生素残留的健康风险问题刻不容缓。

自动QuEChERS 前处理设备是一款由自动程序控制分析样品制备的设备，将立体8 字震荡和离心有机融为一体，通过配套试管的联合使用有效实现了样品中待测成分的提取、分离和转移，提高了样品的前处理效率。目前，国内对于磺胺类抗生素残留量的分析方法主要针对于动物产品以及环境介质，关于蔬菜中磺胺类药物残留量的检测方法仅有少量文献研究报道。

本研究针对畜禽养殖过程中常用的磺胺类药物，利用全自动QuEChERS 技术结合LC-MS/MS 法检测蔬菜中16 种磺胺类药物残留量。该方法自动化程度高、操作简便、快速、重现性好，能够有效满足蔬菜中磺胺类抗生素残留量的快速筛查和定量工作需求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：SCIEX TripleQuad 5500 三重四极杆质谱仪（美国SCIEX 公司）以及MultiQuant 数据处理系统，SiO-6512 自动样品制备系统（北京本立科技公司）。

试剂：乙腈、甲醇（色谱纯，美国默克公司），甲酸、冰乙酸（色谱纯，美国默克公司），分散固相萃取整合套管（北京本立科技公司），16 种磺胺混合标准溶液（天津阿尔塔科技有限公司），成分明细见表1。

表1 16种磺胺的保留时间、质谱参数、相关系数、平均回收率及相对标准偏差（n=6）

1.2 色谱条件

流动相A：0.1%甲酸水。流动相B：甲醇。梯度洗脱程序：0～0.5 min，2%B；0.5～1.5 min，2%～15%B；1.5～2.5 min，15%～40%B；2.5～8.0 min，40%～70%B；8.0～11.0 min，70%～98%B；11.0～13.0 min，98%B；13.1～15.0 min，2%B。色谱柱：ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl（2.1 mm×100 mm，1.7μm）。流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样体积2μL。

1.3 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式。检测方式为多反应监测模式，离子源温度550 ℃，喷雾电压5 500 V，气帘气压力206.8 kPa，雾化气压力413.7 kPa，辅助雾化气压力482.6 kPa，监测离子对及其质谱参数见表1。

1.4 样品前处理

将粉碎后的新鲜蔬菜经低温冷冻干燥后过筛备用。准确称取2.0 g 蔬菜冻干粉于套管的外管中，加2%乙酸水5 mL 浸润30 min 后加入20 mL 乙腈、一包氧化锆珠、盐包（内含5.5 g 无水硫酸镁、1.5 g 氯化钠、0.5 g 柠檬酸氢二钠、1.0 g 柠檬酸钠），将净化内管（100 mg PSA、30 mg GCB、600 mg MgSO4）插入外管中，旋涡混匀后放入全自动样品制备系统中处理。

处理完成后，从内管中取清液2 mL，在40 ℃氮气下吹至近干，使用10%乙腈水1 mL 复溶，过0.22 μm 滤膜后供LC-MS/MS 测定。

2 结果分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

采用针泵注射直接进样的方式对16 种磺胺进行优化。参考欧盟指令2002/657/EC，每个化合物选择1 个母离子、2 个子离子作为定量与定性离子对，详细质谱参数见表1。本试验采用scheduled MRM 扫描方式，使每个色谱峰能够采集15 个数据点，确保定量的重复性和灵敏度。

2.1.2 色谱条件的优化

本试验研究的16 种磺胺类抗生素中有5 种同分异构体，因此色谱柱的选择和色谱条件的优化极为重要。尝试使用沃特世的C18、T3 以及Fluoro-Phenyl 共3 种色谱柱对16 种磺胺进行分离。结果显示，C18、T3 和Fluoro-Phenyl 柱对其中的14 种磺胺类药物均能实现良好的分离。在C18 和T3 柱上磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的色谱峰重合，尝试调整液相色谱条件，均不能实现基线分离，而Fluoro-Phenyl 柱能够较好地分离这2 种同分异构体（见图1）。本试验最终选择Fluoro-Phenyl 柱。

图1 磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪在3种色谱柱上的色谱图

为获得最佳的分离效果和灵敏度，比较了0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇和0.2%甲酸水-甲醇3 组流动相。结果表明，在0.1%甲酸水-甲醇组成的流动相中，16 种磺胺类药物具有较好的峰形和较高的响应值，因此本试验最终选择了0.1%甲酸水-甲醇作为流动相。

2.2 样品状态对结果的影响

磺胺类药物是两性化合物，提取时可通过控制样品提取液pH 值为2～3，使其氨基质子化。测定新鲜蔬菜样品时，提取溶液的pH 值会因样品基质种类的不同而产生较大波动，导致回收率为31.7%～62.8%。使用蔬菜冻干粉，加入乙酸水水化，结合盐包中的缓冲盐，可形成缓冲溶液，抑制样品基质对提取液pH 值的影响，有效提高提取效率，回收率能达到62.3%～88.7%。

2.3 加水体积优化

由于蔬菜冻干粉含水量低，直接用有机溶剂难以将目标物全部提取出来，必须加入一定量的水。称取2 g 冻干粉，分别加入2、5、10 mL 的2%乙酸水溶液，震荡浸泡30 min。结果显示，使用2 mL 乙酸水浸泡时，不能将样品完全溶解，仍有蔬菜粉浮在表面，经乙腈提取后，其测定结果较5 mL 时平均低了12.6%～35.6%；使用15 mL 乙酸水时，20 mL 乙腈不能完全将其提取出来，需要用乙腈重复提取才能达到效果。因此，最终确定样品量为2 g 时，加水体积为5 mL。

2.4 净化条件的优化

QuEChERS 方法中常用的吸附剂有PSA、C18及GCB 等。试验以芹菜为基质，在20 μg/kg 的水平下考察不同量的吸附剂对回收率的影响。结果表明，PSA 的加入量在50～200 mg 时，回收率无明显变化；C18使用量的变化对16 种磺胺无明显影响，对基质效应也没有明显影响。随着GCB 使用量的增加，16 种磺胺的回收率减少了1.84%～24.50%，但考虑到色素对基质效应的影响，最终确定了GCB的使用量为30 mg。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系与定量限

配制5～100 μg/L 的系列混合标准溶液进行分析测定，以各组分的峰面积（y）对质量浓度（x）绘制标准曲线。16 种磺胺具有良好线性关系，相关系数均≥0.998（见表1）。考虑到磺胺类药物在动物性食品中最低的残留限量为25 μg/kg 和方法稀释倍数，最终确定了16 种磺胺类药物的方法定量限（LOQ）为5 μg/kg。

2.5.2 回收率与精密度

取结球甘蓝、芹菜、番茄、马铃薯4 种样品，在5、10 和100 μg/kg 的水平下进行加标回收试验，每个水平平行测定6 次。16 种药物的平均加标回收率62.3%～88.7%，相对标准偏差2.58%～11.26%。

2.6 基质效应评价

选择结球甘蓝、芹菜、番茄、马铃薯用于评价基质效应。将空白样品按照一定的方法处理，分别用基质空白液作为溶剂，配制质量浓度为10μg/L 的标准溶液，测定其峰面积A；以10%乙腈水溶液作为溶剂，配制质量浓度为10μg/L 的标准溶液，测定其峰面积B，公式如下。

根据基质效应的强弱，将其分为3 类，即ME（%）值低于-20%为基质抑制，-20%～20%为弱基质效应，大于20%为基质增强效应。

由图2 可知，16 种农药在甘蓝、芹菜、番茄和马铃薯中多数呈现弱基质抑制效应。

图2 16种磺胺类药物在4种蔬菜基质中的基质效应

2.7 实际样品分析

采用本方法对采集的106 批蔬菜样品进行检测，有7 批样品中共检出3 种磺胺类药物，分别为磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶，平均含量为16.7、11.8、4.8 ug/kg。长期大量施用高抗生素残留的畜禽粪便已成为蔬菜生产中的不安全因素。

3 讨论

文章采用全自动QuEChERS 前处理设备对蔬菜样品进行提取和净化，建立了检测蔬菜中16 种磺胺类药物残留的液相色谱-串联质谱方法。本方法自动化程度高，批量处理样品耗时短，相对于传统的QuEChERS 方法具有更高的批间精密度，操作简便，大大降低了检测结果的质量对操作人员技术水平的依赖，提高了工作效率，为快速测定蔬菜中磺胺类药物残留提供了技术手段。