酚类化合物的提取以及在养鸡生产中的应用

余志雪， 王 辉， 熊本海 ， 石芳权

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2. 甘肃省西和县畜牧兽医站，甘肃陇南 742100）

根据农业农村部第194 号公告的要求，2020年1 月1 日起退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。禁抗令的实施，使养殖产业链受到了很大影响。目前，饲料全面禁抗是继非洲猪瘟和新冠肺炎疫情后， 我国畜牧业面临的又一个新的挑战。发展绿色养殖，减少养殖过程中抗生素的使用，提高畜禽的抗病能力已迫在眉睫。酚类化合物是植物次生代谢的产物， 具有很强的抗氧化能力，有益于动物的健康，可作为动物的天然饲料添加剂。 此外， 农业副产品是酚类化合物的极好来源，可用作畜禽饲养中的功能性成分，有较广泛的市场前景和应用潜力。 同时有利于更好的发展绿色健康的畜牧业，增加畜禽产品出口销量，确保人类的健康，也有利于提高畜产品的经济价值，创造更高的社会效益。

1 酚类化合物的分类与功能

酚类化合物是植物次生代谢产物， 主要来源是植物组织，如谷物、蔬菜、水果、树木及其提取物等（Xu 等，2021）。 可定义为具有苯环和一个（苯酚）或多个（多酚）羟基的化合物。在食品工业中应用的酚类化合物主要有：（1）具有一个芳香环的酚酸，进一步细分为羟基苯甲酸（如原儿茶酸、香草酸和丁香酸）和羟基肉桂酸（如双香豆素、咖啡酸和阿魏酸），这些化合物的抗氧化活性与其分子中羟基的数量有关；（2）类黄酮（如黄烷醇、黄酮、黄烷酮、异黄酮、花青素），它们是天然酚类中最大的子类， 其结构由排列在两个苯环和一个杂环中的15 个碳骨架组成；（3）由两个羰基组成的醌（例如苯醌、蒽醌）；（4）水果中富含的单宁，由醌或类黄酮形成；（5）含有苯环和α-吡喃酮环的香豆素，具有潜在毒性，但如果使用得当，其可发挥较好的抗菌活性；（6） 木脂素；（7） 二苯乙烯；（8） 姜黄素（Gadde 等，2017b；Viveros 等，2011；Franz 等，2010）。 植物精油或挥发油类具有独特的香气，由几种酚类化合物混合组成。 用于食品工业富含酚类化合物的精油通常由牛至（香芹酚、百里香酚）、丁香（丁香酚）、香菜（芳樟醇）、生姜（桉叶醇、冰片、香叶醇、姜黄素）、迷迭香（迷迭香醛、迷迭酸）、百里香（百里香酚、香芹醇）和薄荷（薄荷醇）制备而成（Giannenas 等，2018；Pateiro 等，2018）。

酚类化合物的一个基本特征是具有显著的抗氧化活性，抗氧化物质通过捕获自由基、还原氧、结合金属离子、消除氢过氧化物、吸收紫外线等作用来阻碍氧化反应（Aminzare 等，2019；Fernandes等，2018）。 类黄酮中的酚亚基也可以作为金属螯合剂，主要针对Fe3+，抑制氧化过程（Maqsood 等，2014）。同时，许多酚类化合物是有效的抗菌剂，其通过破坏微生物细胞表面和细胞质膜的稳定来实现（Pisoschi 等，2018；Rempe 等，2017）。 这会导致细胞壁和细胞内各种细胞器的不可逆损伤， 细胞区室的凝固和细胞内酶的抑制。 特别是疏水酚类化合物与微生物细胞膜的脂质双分子层结合，导致其结构破坏和完整性丧失（Devi 等，2010）。 此外， 一些酚类化合物也具有其他有益特性， 如免疫、抗炎、促进肠道健康等。 膳食中添加多酚可以提高动物的生产性能和氧化稳定性（Starevi等，2015）。报道称作为天然代谢产物的酚类化合物可以对抗氧化应激， 而这种应激与严重的代谢紊乱相关， 会对细胞和细胞外大分子造成损害（Furukawa 等，2017）。 酚类化合物中除了单宁、皂苷和有毒生物碱外， 大多数植物提取物在动物饮食中没有显示出抗营养作用。

2 酚类化合物的提取方法

2.1 索氏提取法 索氏提取法是将粉碎的样品放置在木桶中， 然后放在回流冷凝器下收集瓶上方的提取室，加热瓶中添加的溶剂产生蒸汽，在冷水下凝结后回到样品收集器中，最后，从加热瓶中提取水溶液的过程（Alara 等，2021）。 此方法需要的装置相对便宜，并且能产生较高的酚类提取率，但也存在一些缺点：（1）使用大量有害有机溶剂会对环境造成污染；（2）提取时间长；（3）由于光、空气、 高温和酶促反应等内部和外部因素造成对目标组分的干扰和降解（Khoddami 等，2013）。 提取多酚常用的溶剂有甲醇、水、氯仿、正己烷、乙醇、丙醇、乙酸乙酯和丙酮等（Zhang 等，2018）。 这些溶剂的极性不同，因此，它们对植物化学物质的提取有不同的影响。 目前人们对于萃取多酚的最佳溶剂仍有疑问。例如，与甲醇、水和乙醇相比，丙酮被证明能有效地从荔枝花中提取多酚 （Liu 等，2009）。然而，另一项研究报告称，水是从核桃绿皮中提取多酚的更好溶剂 （Fernandez-Agullo 等，2013）。还有研究发现，与绝对有机溶剂相比，水溶液和有机溶剂的混合萃取效率更高 （Metrouh-Amir 等，2015）。 目前没有公认的最佳萃取溶剂，一般认为多酚在极性较高的溶剂中溶解度较高，萃取效果最好。 萃取溶剂的选择需要基于以下因素：溶剂的极性、沸腾温度、黏度、稳定性与安全性以及可重复性。 由于多种因素包括共轭水平和多个羟基的存在对多酚的提取具有一定影响， 因此在萃取之前要进行事先测试和调整最佳溶剂。

2.2 微波辅助提取法 微波能够穿透植物材料并将能量传递至细胞内， 使得细胞破裂并释放其中的物质。 微波辅助提取法通过微波辐射能量来加热溶质-溶剂混合物， 产生的热量有助于溶剂向植物样品中扩散， 同时促进化学物质向样品外扩散（Alara，2019）。 微波辅助提取法已被用于包括酚类物质在内的几种植物化学物质的提取，其可以在更短的时间和更少的溶剂消耗条件下提供更高的多酚提取率（Alara 等，2018）。然而，当使用该技术提取多酚时，还需要考虑样品的类型、溶剂的类型和纯度、微波应用的功率和时间、样品可用表面积以及操作温度等。 最关键的因素是溶剂的类型， 在选择溶剂时必须同时考虑其对酚类化合物的亲和力和微波能量吸收能力 （Zhang 等，2011）。 己烷或二氯甲烷则不适用于微波辅助提取，因为它们不能在微波辐射下加热。 其他溶剂，如甲醇、乙醇或水，具有良好的微波吸收能力，容易升温，可以缩短微波功率的应用时间，并且这些溶剂对热不稳定性化合物没有严重影响， 因此适合在工艺中使用（Dudley 等，2015）。

2.3 超声辅助提取法 超声辅助提取利用微小气泡爆炸引起的机械影响，使组织快速分解，从而促进植物化学物质扩散到溶剂中， 是一种简单且低成本的方法（Shirzad 等，2017）。 近年来，越来越多的人使用超声辅助提取植物中的多酚（Yu 等，2017）。 提取过程一般需要使用20 ～2000 kHz 频率的超声波来增加细胞壁的通透性。 与其他提取技术相比，超声辅助提取可以更快、更好地提取多酚，同时最大限度地减少化合物的分解（Vinatoru，2001）。报道称超声辅助提取在提取迷迭香和鼠尾草酸方面比传统提取技术更有效 （Zu 等，2012）。还有报告显示， 使用超声辅助提取法从云杉树皮中提取多酚的最高提取率为13.20 mg/g（Ghitescu等，2015）。 使用超声波辅助提取增加了多酚在提取溶剂中的溶解度， 减少了化学回收所需的溶剂体积。 较短的超声时间和较低的超声温度有利于酚类化合物的提取和保存。与传统方法相比，超声辅助提取法是最简单、最便宜的提取方法之一，可以在各种溶剂中快速操作， 适用于工业用途的大规模制备（Lee，2007）。

2.4 酶辅助提取法 近年来，酶辅助提取法逐渐被应用于植物酚类物质的提取。 利用酶分解细胞壁使细胞质内容物释放到提取液中， 从而提取多酚化合物（Puri 等，2012）。木质素是一种坚韧的植物细胞壁成分， 大多数植物化学物质通过氢键或疏水键与木质素结合，难以获得，因此，需要酶处理来促进与木质素结合的植物化学物质的有效释放（Gomez-Garcia 等，2012）。 纤维素酶、半纤维素酶、 果胶酶等经常被用来提取植物中的酚类化合物，其可以水解细胞壁木质素，并提高提取效率。张悦怡（2015）采用超声辅助提取法和酶辅助提取法提取五味子中的酚类物质， 相较于超声辅助提取法（1.19%），酶辅助提取法（2.13%）的酚类物质提取率更高。 De 等（2016）认为，酶辅助提取法是从酿酒废料中更好地提取碳水化合物结合酚的替代技术。 此外，这种方法用水作为溶剂，代替有机溶剂，因此被认为是一种环保的提取方法。

3 酚类化合物在养鸡生产中的应用

3.1 提高免疫力、增强免疫功能 酚类化合物已被证明具有免疫增强作用， 在日粮中添加酚类化合物可以改变和稳定鸡的肠道菌群并减少肠道中的微生物毒性代谢物，从而缓解肠道免疫应激，增强免疫功能。 酚类化合物对免疫功能的基本作用方式是产生免疫球蛋白和分泌细胞因子， 增强吞噬作用，促进干扰素γ（IFN-γ）释放（Christaki 等，2020）。多酚可通过影响MAPK 和核因子κB（NF-κB）信号通路激活单核细胞，增强吞噬反应（Artuso-Ponte 等，2020）。 酚类化合物也会增强十二指肠功能和对营养物质的吸收， 从而加强鸡的免疫功能和生长性能（Adaszyńska-SkwirzyńskaSzczerbińska，2017；Sheoran 等，2017）。此外，膳食多酚通过刺激免疫球蛋白和抑制促炎细胞因子的分泌来改善鸡的肠道健康和免疫力（Lipiński 等，2017）。酚类化合物也可以发挥抗氧化酶的过度表达，从而下调炎症反应（Rubió 等，2013）。 报道称，精油的抗炎特性与涉及各种细胞因子和调节转录因子的信号级联反应以及它们的促炎基因表达能力有关（Miguel，2010）。 同样，不同的生物碱（异喹啉、乙酰水杨酸）也被证明具有抗炎作用，因为它们可以降低促炎细胞因子的表达 （Soler-Vasco 等，2016）。 富含酚类化合物的生物碱可以通过抑制NF-κB 的激活来影响炎症级联反应，从而对肠道健康发挥作用（Artuso-Ponte 等，2020）。 植物类黄酮染料木素（5 mg/kg）和橙皮苷（20 mg/kg）已应用于受脂多糖（LPS）刺激的肉鸡，并显示出对免疫刺激和改善肠道形态的有效作用（KambohZhu，2014）。 饲粮中添加150 mg/kg 富含皂苷的无患子可提高肉仔鸡的细胞免疫和体液免疫应答， 且对最佳体重无不良影响（Bera 等，2019）。 在LPS 刺激下的肉仔鸡中，饲粮中添加200 μL/L 的香芹酚精油作为酚类化合物可以阻止炎症细胞因子的表达， 从而确保香芹酚在肉仔鸡中的抗炎作用（Liu等，2019）。 研究表明，500 mg/kg 的酚类化合物白藜芦醇可通过抑制热应激引起的不同信号通路，如NF-κB、MAPK 和PI3K/AKT 来调节黄羽肉鸡的免疫功能和炎症反应（He 等，2019）。 以上研究结果表明， 酚类化合物对增强鸡的免疫力和抗病力，有效预防病毒、细菌对肠道和肠道微生态的破坏和感染， 促进肠黏膜上皮免疫细胞因子的表达具有重要功效。

鸡的免疫功能与免疫器官的发育密切相关，其中胸腺、 脾脏和法氏囊的发育程度直接影响机体的免疫功能（上官明军等，2009）。 胸腺、脾脏和法氏囊是参与家禽体液免疫与细胞免疫的重要器官，胸腺参与细胞免疫，而脾脏是家禽最大的外周免疫器官，法氏囊是家禽特有的免疫器官，其主要功能是参与体液免疫。 免疫器官的重量与其细胞增殖率和免疫功能密切相关。 朱晓磊等（2013）研究表明，百里香酚可提高麻花鸡的胸腺指数，但对脾脏指数有负面效应。周洪彬等（2020）指出，植物精油对肉仔鸡生长性能和免疫功能具有一定的促进作用，在试验中添加100 mg/kg 植物精油C（肉桂醛与百里香酚有效含量为10%） 的效果最佳，且接近抗生素饲喂效果， 说明其具有作为抗生素替代物的潜力。

3.2 疾病防治

3.2.1 治疗鸡新城疫 鸡新城疫是由病毒引起的一种急性败血性传染病，在生产中也叫“鸡瘟”。新城疫的主要特征是高死亡率， 死亡率可达100%（Okoroafor 等，2019）。 新城疫病毒在感染宿主体内引起的炎症反应通常会导致细胞凋亡和组织损伤，在法氏囊感染的严重程度与促炎细胞因子、趋化因子、凋亡、巨噬细胞浸润和氧化应激的诱导水平有关（Subbaiah 等，2015）。 新城疫病毒可通过口咽分泌物和粪便传播给健康禽类，易感禽类通过吸入受污染的灰尘或气溶胶状病毒，或通过摄入禽类粪便中释放的病毒而感染。临床症状取决于禽类的年龄和品种、病毒株、免疫状况和环境条件（Al-Habeeb等，2013）。临床表现可分为生殖、呼吸、神经和肠道症状。生殖器官感染的临床表现包括：卵数下降、卵畸形、蛋壳粗糙或粗短、蛋白质量下降。产蛋量在3～4 周后恢复正常水平（Yan 等，2011）。呼吸道感染的症状包括轻微的打喷嚏和大口喘气。更严重的症状是咳嗽、流鼻涕和张嘴呼吸。 神经感染的症状包括翅膀震颤和腿瘫痪、颈部扭曲和盘旋，肠道感染伴有绿色腹泻（Nurzijah 等，2022）。

近年来研究表明， 不同植物中酚类化合物对鸡新城疫病毒具有良好的治疗效果。 Salih 等（2017）研究了橄榄提取物对新城疫病毒的抗病毒活性，为此，监测新城疫病毒两种结构蛋白在鸡成纤维细胞中的基因表达， 并利用qRT-PCR 分析其对病毒复制的影响。 通过检测病毒和宿主基因表达，分析IFN-β 的病毒限制性活性。 对新城疫病毒复制的体外分析表明， 用橄榄提取物处理的鸡细胞显著限制了新城疫病毒的复制。 向双云等（2017）通过测定饲粮中添加黄芪多糖作为免疫增强剂时，鸡的免疫器官和抗体水平变化，得出黄芪多糖对鸡新城疫疫苗免疫具有增强作用， 能够促进鸡免疫器官的生长并发挥免疫作用， 提高鸡体内的抗体水平， 可以作为免疫增强剂来治疗鸡新城疫。 Naveed 等（2020）发现，天然提取的大豆皂苷在激发肉鸡体液免疫反应方面非常有效， 且大豆皂甙比灭活新城疫疫苗具有更高的免疫作用。

3.2.2 治疗鸡传染性支气管炎 鸡传染性支气管炎是养鸡生产中常见的疾病， 是由传染性支气管炎病毒引起的急性、 高度接触性呼吸道传染病（Zhang 等，2017）。 呼吸困难、发出罗音、咳嗽、打喷嚏等是其主要症状。 传染性支气管炎不仅会损伤呼吸道， 还会对消化系统和泌尿生殖系统造成损伤，导致呼吸道疾病、间质性肾炎和输卵管发育不良等（Zhong 等，2016）。 已有研究表明，传染性支气管炎病毒不仅会因死亡率高、 继发性细菌感染、 肉制品生产质量差和鸡蛋质量差造成直接损失， 还会因预防病毒的药物和疫苗接种成本增加而造成间接损失（Liang 等，2019）。

酚类化合物治疗鸡传染性支气管炎主要有两种作用途径：一是直接作用于病毒，阻断病毒繁殖抑制病毒再生；二是间接作用病毒，通过调节机体的免疫系统从而达到抗病毒的效果。 Chen 等（2019）研究发现，贯叶连翘的提取物（含金丝桃苷、槲皮素、假金丝桃素和金丝桃素）具有抗传染性支气管炎病毒活性， 抗病毒作用可能与通过NF-κB 信号通路降低促炎细胞因子IL-6、TNF-α的mRNA 表达水平有关，也可能与通过MDA5 信号通路上调I 型干扰素的mRNA 表达水平有关，这有助于新型抗病毒药物的开发。 薛洋等（2017）研究发现，在日粮中添加高、中剂量的黄芩苷均对雏鸡感染传染性支气管炎M41 所产生的T 淋巴细胞亚群减少及紊乱产生较好的促进增殖及调节作用。此外，Islam 等（2017）试验结果表明，蔓越莓的高酚含量和抗氧化活性有助于控制传染性支气管炎的发生。 短期注射蔓越莓提取物可提高肉鸡血清免疫球蛋白水平， 从而加强肉鸡对病毒的体液反应。传染性支气管炎对雏鸡的影响更大，使雏鸡对饲料的利用率降低， 从而导致体重增加速度缓慢。 感染期间和感染后生产效率低下导致产蛋潜力降低70%以上（Khataby 等，2016）。 在高度易感的家禽中，产蛋量可能会恢复，但峰值产蛋率可能会永久降低。

3.2.3 治疗鸡球虫病 鸡球虫病在生产中也很常见， 是由一种或多种艾美球虫引起的急性流行性寄生虫病。鸡的胃肠道具有多样化的微生物群落，在消化和保护中起着至关重要的作用， 艾美球虫会对肠道环境进行破坏。 球虫感染导致肠道内稳态失衡，推动梭状芽孢杆菌等病原体增加。球虫感染也会影响肠道微生物群的组成和完整性， 导致鸡对疾病的易感性升高， 这些疾病对鸡的健康和生产力构成严重威胁（Madlala 等，2021）。 病后痊愈的鸡生长缓慢，发育迟缓，病鸡的增重和产蛋性能大幅下降。 抗球虫药物已被证明可有效抑制球虫病，但存在许多缺点，例如耐药性和肉类中的药物残留等， 因此人们越来越关注具有抗球虫特性的植物生物活性物质。

植物提取物的抗菌特性被认为有助于保护肠上皮免受球虫损伤。 多酚作为芳香植物最重要的成分之一， 其对许多胃肠道寄生虫表现出抗寄生虫活性。 这种活性被认为是由于酚类成分的疏水潜力， 使得它们能够在细菌细胞壁和线粒体中分配脂质， 扰乱膜结构并增加它们的渗透性（Lambert 等，2001）。 酚类的抗菌作用主要影响细菌细胞壁的结构， 还可以通过与细胞质膜相互作用改变其对阳离子如H+和K+的渗透性对宿主肠细胞产生影响（Weber，1996）。 离子梯度的消散导致细胞内基本过程受损和细胞成分泄漏，导致水失衡、膜电位崩溃和抑制三磷酸腺苷（ATP）合成，最终细胞死亡（Ultee 等，1999）。 何梦晓等（2017）研究发现， 饲粮中添加一定量的茶多酚和茶皂素可提高感染球虫病肉仔鸡的生长性能和抗氧化能力，并改善盲肠的微生物组成。另外，研究称茶提取物中含有的酚类化合物和硒， 可能具有抑制球虫卵囊产孢过程中酶的能力。 由于茶多酚能够穿透卵囊壁到达孢子体并改变细胞分裂的趋势， 因此显著降低了三种艾美耳球虫卵囊的产孢量， 改变了卵囊内孢子的形态 （Molan，2015）。 Manei 等（2020）发现，饲喂姜黄提取物（姜黄素）有效减少了卵囊的产生、 降低了盲肠病变评分并改善了盲肠的组织病理学。

3.3 提高生产性能 源自植物的酚类化合物大多被认为对饲料的风味和适口性有益， 从而提高动物的采食量和生产性能。 酚类化合物作为潜在的动物生长促进剂，通过增强消化酶分泌（内源性消化酶、唾液、胆汁和黏液）和减少胃肠道中的致病菌数量或通过其抗氧化和抗炎功能来调节肠道形态（Valenzuela-Grijalva 等，2017）。研究指出，饲喂酚类化合物的家禽具有较高的生长速率和饲料转化率的原因是改变了肠道表面积和消化酶活性， 从而提高了营养物质的吸收率（Mountzouris等，2011）。 酚类化合物能够保持胃肠道中有益菌和致病菌的最佳平衡， 有助于保持肠道健康和促生长性能。 酚类化合物的促生长性能也可以通过改善饲料状态来证明， 在饲料中添加酚类物质可以更好的促进饲料发酵和对营养物质的吸收，并对宿主组织产生直接或间接的合成代谢作用（Valenzuela-Grijalva 等，2017）。然而，酚类化合物的作用机制还可能受其结构、饲喂量、动物种类、动物生长阶段和试验持续时间的影响。 Abdel-Wareth 等（2012）通过试验评估了百里香和牛至精油（百里酚和香芹酚）对肉仔鸡的作用，并观察到补充日粮组的平均日增重和饲料转化率均高于对照组， 得出在饲粮中添加15、20 g/kg 的百里香和牛至可改善肉鸡生长性能。 饲粮中添加百里香酚和香芹酚主要通过提高消化酶活性来提高肉鸡平均日增重和饲料转化率 （Hashemipour 等，2013）。 此外，日粮中添加150 mg/kg 牛至粉可增加约8.4%的平均日增重，同时在整个试验期肉鸡的采食量增加7.9%（Ri 等，2017）。 饲粮中添加0.3 g/kg 百里香精油对改善肉鸡肠道形态和提高消化酶活性具有显著作用（Yang 等，2018）。 添加0.3 g/kg 肉桂油可提高商品肉仔鸡5.1%的日增重， 提高营养物质消化率， 降低粪便中含氮量（Chowdhury 等，2018）。 单宁酸作为栗木酚类化合物，饲喂2 g/kg 对肉鸡生长性能无影响，但能降低肉仔鸡脚垫皮炎损伤的发生率。 单宁对肉仔鸡生长的抑制作用可能是由于单宁的抗营养作用导致肉仔鸡蛋白质结合能力下降， 高剂量单宁可降低肉仔鸡对营养物质的消化率（Cengiz 等，2017）。饲粮中添加100 mg/kg 牛至精油可提高产蛋率5%，提高蛋重、 饲料转化率、 淀粉酶和胰蛋白酶活性（He 等，2017）。 研究发现，在北京鸭中，添加0.2%的葡萄籽提取物（花青素、儿茶素）作为酚类化合物，可增加约3.1%的末重，提高饲料转化率、抗氧化能力、 免疫力、 肉质和肠道有益菌群（Ao，2020）。另外，许多酚类化合物还具有健脾益胃、增强食欲等功能，还含有多种必需氨基酸、维生素和矿物质元素，可以帮助消化，提高饲料转化率，促进机体生长发育。 由于肠道生态系统的变化，酚类化合物的添加显著改善了饲料转化率， 从而提高了营养物质的利用率。

4 结论

随着饲料工业的不断发展， 植物提取物添加剂的使用越来越广泛， 酚类化合物是饲料添加剂中最有前途的种类之一，可作为抗生素的替代品。目前生产上对酚类化合物的提取仍然采用传统工艺，存在提取过程耗费时间长、效率低且提取物纯度低等问题， 难以满足养殖业对酚类化合物添加剂的数量及质量需求。 而使用现代技术提取时不仅可以在时间、 效率等方面有所提高， 而且更安全、环保，更有利于保持化学成分所特有的生物活性， 因此在实际生产中应综合利用现代提取分离技术有效地提取酚类化合物并提高其提取率。 同时酚类化合物作为潜在的天然饲料添加剂， 对家禽免疫、疾病和生产性能具有一定的作用。为了从这些天然化合物中获得优势， 应对酚类化合物的药理作用进行深入研究，明确其作用机理，根据家禽的特定情况选择合适的酚类化合物以及最佳补充水平进行饲粮添加。