基于体外消化筛选黄芩抗氧化成分的提取工艺研究

叶敬榕， 林 彦， 段涵怡， 杨 雪， 任晓岚， 张凤英

（1.承德医学院中药研究所，河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.承德医学院基础医学院，河北承德 067000）

黄芩，最早记载于《神农本草经》中，气微、味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效（中国药典，2020）。 现代药理学分析发现，黄芩的药理活性是多方面的，其在抗肿瘤、抗病毒、调节免疫、促进细胞凋亡等诸多方面均有作用（罗勇，2022；李化，2020；Singh，2020；Li，2020）。 研究表明，黄芩提取液中含有大量的黄酮类、多糖类及多酚类化合物， 这些化合物均可清除体内多余自由基，从而达到强抗氧化效果（Hui，2022；Woniak，2015；赵二劳，2012）。

自由基是具有未成对电子的原子、 原子团或分子，人体主要含有氧自由基（活性氧）和氮自由基（活性氮）两大类。当活性氧、活性氮与机体的抗氧化防御机制平衡被打破时， 就会引发线粒体产生氧化应激反应（Pandya，2021），导致肝炎、癌症、糖尿病、心脏病、风湿性关节炎、骨关节炎以及神经退化性疾病，如帕金森病、阿尔兹海默症等（朱烨，2022；Jabeen，2021；Legiawati，2021；Zhu，2021）。有研究表明， 黄芩提取液可作为天然的抗氧化剂使用，能够有效抑制自由基的产生，减弱氧化应激反应对机体的损伤， 降低重大疾病发病率（高可新，2021；Wang，2021）。 因此，研究黄芩抗氧化活性物质的提取具有重要意义。

目前， 对于黄芩活性物质的提取主要有水提法、有机溶剂提取法、酶解法、超声等物理手段辅助提取法（金尧，2021；辛莹娟，2021；叶润，2019）。不同的提取方式会使得黄芩提取液中活性成分不同，进而造成黄芩提取物的抗氧化活性存在差异，但黄芩提取物经过胃肠消化后产物的抗氧化活性是否会发生变化（升高/降低）鲜见报道。 本试验对比两种常见的提取方式：水提和醇提。 并以最佳溶剂为基础，采用单因素试验和析因设计试验，以胃肠模拟消化产物抗氧化活性指标的秩和比为依据，优化相应的提取工艺参数，旨为筛选出最佳的提取工艺，并获得具有高抗氧化活性的黄芩提取物。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 2500 大型粉碎机， 购于运邦公司；C 21-SDHCB 39 电磁炉， 购于浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司；N-1100 旋转蒸发仪，购于上海爱朗仪器有限公司；30ND 中式真空冷冻干燥机，购于宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-501 超级恒温水浴箱， 购于常州澳华仪器有限公司；ZD-85A 气浴恒温振荡器， 购于常州荣华仪器制造有限公司；1510 酶标仪， 购于赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific） 公司；OHAUS AR 224CN 分析天平， 购于奥豪斯仪器上海有限公司；Velocity 18R台式冷冻高速离心机，购于Dynamica 公司。

1.2 试剂 黄芩，产地西安；胃蛋白酶、胰酶、猪胆粉均购自上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，AR）购自上海吉至生化有限公司；无水乙醇、硫酸亚铁七水合物、水杨酸、双氧水、pH 7.60 磷酸盐缓冲液、铁氰化钾、三氯乙酸、 无水三氯化铁、 焦性没食子酸、 过硫酸钾、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）等试剂均购自阿拉丁试剂有限公司。

2 试验方法

2.1 黄芩抗氧化成分的提取溶剂筛选

2.1.1 水提黄芩抗氧化成分 参照翟阳等（2020）的方法略有修改，取干燥黄芩药材，粉碎过20 目筛，得到黄芩根粉，取黄芩根粉50 g 包煎，第1 次加1583 mL 纯水，用电磁炉先大火煎煮，水开后转小火继续煮， 共煮75 min。 第2 次加1267 mL纯水，水煎煮过程同上，共煮60 min。 合并2 次提取液，12000 r/min 离心10 min 后， 再用抽滤漏斗抽滤， 滤液用旋转蒸发仪将其浓缩至200 mL 左右，取出后冻干，收集冻干粉，备用。

2.1.2 醇提黄芩抗氧化成分 参照丛日琳等（2019）的方法略有修改，取黄芩根粉50 g，以70%乙醇为溶剂加热回流提取，水浴锅设置80 ℃，每次加入乙醇量为400 mL，共三次，每次提取2 h。合并3 次提取液，12000 r/min 离心10 min 后，再用抽滤漏斗抽滤， 滤液用旋转蒸发仪将其浓缩至200 mL左右，取出后冻干，收集冻干粉，备用。

2.1.3 复溶冻干粉 按上述的操作步骤制得两种黄芩提取物冻干粉，各称取1 g，再用20 mL 原溶剂复溶制样，在搅拌混匀状态下吸取1200 μL 于离心管中，分别命名为水提水溶和醇提醇溶。但考虑到人体实际情况， 多数是以水作为溶剂而无法产生大量乙醇，故追加一组醇提水溶。三组样品制样结束后12000 r/min 离心10 min， 分装上清液，用于体外胃肠模拟消化。

2.2 体外胃肠模拟消化参照Ketnawa 等（2016）和陈希苗等（2019）的方法略有修改，胃消化组：调节黄芩提取液的pH 至2.0 左右，加入2%（E/S）的胃蛋白酶，于37 ℃气浴摇床中反应2 h，反应结束后，取出于金属浴95 ℃条件下灭酶10 min，冷却后再调节pH 至8.0 左右， 于12000 r/min 离心10 min 取上清液，待测。胃肠消化组：以同样的方法模拟胃消化， 结束后迅速调节其溶液pH 调节至8.0 左右，加入2%（E/S）的胰酶与12.5%的猪胆粉，于37 ℃气浴摇床中反应4 h，反应结束后于金属浴95 ℃灭酶10 min，于12000 r/min 离心10 min 取上清液，待测。

2.3 黄芩抗氧化成分的水提工艺优化

2.3.1 单因素试验 根据前期的试验结果证实水提优于醇提，故持续优化黄芩的水提工艺，并按照表1 中设定的因素和水平进行单因素试验。（其中筛选液料比单因素时，采用固定黄芩用量，改变纯水用量，并将最后总体积调成一致）。

表1 单因素试验因素与水平

2.3.2 析因试验 根据单因素试验的结果， 固定温度单因素（保持微沸），对时间单因素和液料比单因素进行两两组合的析因试验，组合结果见表2。

表2 析因设计试验组合详情

2.4 体外抗氧化指标的测定

2.4.1 DPPH 自由基清除率的测定 参照王美英等（2021）的方法略有修改，为了使DPPH 自由基清除率结果在线性范围之内，将水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶样品稀释至30 倍，单因素试验样品稀释至10 倍，析因设计试验样品稀释至10 倍。

取100 μL 样品溶液加入100 μL DPPH（0.1 mol/L，溶于乙醇）。 然后将混合物37 ℃下保持在避光条件下反应30 min， 并在517 nm 处测定吸光度。样品对DPPH 自由基清除率计算公式如下：

式中：A0为乙醇代替样品的吸光度，A1为样品的吸光度，A2为乙醇代替DPPH 的吸光度。

2.4.2 总抗氧化能力的测定 参照王美英等（2021） 的方法略有修改， 将7 mmol/L ABTS 与2.45 mmol/L 过硫酸钾等体积混合静置过夜12 h，制成ABTS 母液。用无水乙醇将母液稀释，使其在波长734 nm 处吸光度为（0.20±0.02），制得ABTS工作液。

将水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶样品稀释至1500 倍，单因素试验样品稀释至100 倍，析因设计试验样品稀释至300 倍。

取100 μL 样品溶液于96 孔板中，加入100 μL的ABTS 工作液，避光反应6 min 后，于波长734 nm处测得吸光度。 样品的总抗氧化能力计算公式如下：

式中：A3为以蒸馏水代替样品吸光度，A4为样品吸光度，A5为蒸馏水替代ABTS 工作液的吸光度。

2.4.3 ·OH 自由基清除率的测定 参照陈建双等（2021）的方法略有修改，将水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶样品稀释至10 倍，单因素试验样品不进行稀释，析因设计试验样品稀释至3 倍。

取200 μL 样品溶液于离心管，对应加入Fe-SO4溶液（9 mmol/L）、水杨酸溶液（9 mmol/L，溶于乙醇）和H2O2溶液（8.8 mmol/L）均200 μL 摇匀，于37 ℃气浴20 min，冷却后离心，取上清200 μL，放入96 孔板，于波长510 nm 处测定吸光度。 样品对·OH 自由基清除率计算公式如下：

式中：A6为以蒸馏水代替样品吸光度，A7为样品吸光度，A8为蒸馏水替代H2O2溶液的吸光度。

2.4.4 总还原能力测定 参照范琳等（2021）的方法略有修改，将水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶样品稀释至30 倍， 单因素试验样品稀释至2 倍，析因设计试验样品稀释至30 倍。

取不同样品溶液100 μL 于试管中， 分别加入100 μL 0.2 mol/L PBS 缓冲液和100 μL 质量分数为1% K3Fe（CN）6溶液，于50 ℃下水浴反应20 min，冷却后，加入100 μL 质量分数为10%三氯乙酸，离心，取上清100 μL，放入96 孔板，加入100 μL 质量分数为0.1% FeCl3溶液，摇匀，静置，在波长700 nm 处测定吸光度。 样品的总还原能力计算公式如下：

总还原能力=A9-A10；

式中：A9为样品吸光度，A10为蒸馏水代替K3Fe（CN）6溶液测定吸光度，以蒸馏水作为空白调零，结果数值越大说明其总还原能力越好。

2.4.5 超氧阴离子清除率测定 参照范琳等（2021）的方法略有修改，采用邻苯三酚自氧化法测定对超氧阴离子的作用。 将水提水溶、 醇提醇溶、醇提水溶样品稀释至30 倍，单因素试验样品不进行稀释，析因设计试验样品稀释至10 倍。

取Tris-HCl 溶液125 μL 和样品液75 μL 混匀，25 ℃条件下放置4 min，加入邻苯三酚75 μL，5 min 后于波长325 nm 处测定。 样品对超氧阴离子清除率计算公式如下：

式中：A11为以蒸馏水代替样品吸光度，A12为样品吸光度，A13为蒸馏水替代邻苯三酚溶液的吸光度。

2.5 数据分析与制图 数据结果采用SPSS 23.0软件（IBM 公司，NY,USA）进行单因素方差分析。图表采用WPS office （北京金山办公软件股份有限公司）绘制，表中不同的字母表示不同处理方法在相同阶段下的显著性（P ＜0.05，n=3）。

3 结果

3.1 黄芩抗氧化成分提取溶剂的选择 水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶三组经过复溶、离心后，其析出的沉淀量不同。对沉淀进行烘干称重，水提水溶组析出最少，为0.0030 g；醇提水溶组其次，为0.0056 g；醇提醇溶组最多，为0.0518 g。三组复溶溶液及其胃肠模拟消化产物的五种抗氧化活性指标结果见表3。 由表3 可知，不同的复溶方式对黄芩提取物的抗氧化活性具有显著影响（P ＜0.05）。且经过胃肠模拟消化后， 五种指标呈现出不同的趋势。但总体而言，水提水溶组和醇提水溶组会优于醇提醇溶组。 对比胃肠模拟消化后产物的抗氧化活性，可以发现DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率、·OH 自由基清除率是水提水溶组最高，分别为42.54%、55.41%、59.36%。 而总还原能力、超氧阴离子清除率却是醇提水溶组较高，分别为1.52、67.95%。

表3 3 种复溶溶液及其胃肠模拟消化后产物的抗氧化活性及秩和处理结果

对这五种抗氧化指标进行秩和处理， 并对秩和比（RSR 值）进行排序，RSR 值越大排序越高，相应的综合抗氧化活性也高。 通过表中数值可以发现， 醇提水溶组在经过胃肠模拟消化后，其RSR 值排序情况是逐步不如水提水溶组，由提取物的排序1 降至胃消化的排序1.5，再到最终胃肠消化结束后的排序2。 其原因可能是醇提水溶溶液中的有效成分逐步被胃肠消化液中的酶所破坏而丧失其抗氧化活性。而水提水溶组，在经过胃肠模拟消化后， 其抗氧化活性较原提取物显著提高（P ＜0.05），这可能与黄芩中的主要成分黄芩苷易溶于热水（孟倩，2007），再经过消化后被水解成更多的黄芩苷元，而发挥抗氧化作用有关。

3.2 单因素试验优化黄芩水提工艺结果

3.2.1 提取温度对黄芩提取物抗氧化活性的影响根据上述的试验结果可知水提水溶组经过胃肠模拟消化后的抗氧化活性最高， 故现采用单因素试验的方法优化黄芩水提工艺。由表4 可以发现，随着温度的逐步升高， 各指标的抗氧化活性也在显著增加（P ＜0.05）。对比胃肠模拟消化后产物的抗氧化活性， 可以发现五种指标均是保持微沸的最大，分别为DPPH 自由基清除率44.09%、ABTS+自由基清除率77.41%、·OH 自由基清除率85.19%、总还原能力3.02、超氧阴离子清除率97.73%。 而通过秩和处理后证实了温度对黄芩提取物的抗氧化活性具有非常大的影响， 且传统的保持微沸可以使其抗氧化活性最大化。

表4 温度对黄芩提取液及其胃肠模拟消化后产物的抗氧化活性及秩和处理结果

对比100 ℃水煮与保持微沸的数据可以发现，两者无论是原提取物还是胃肠消化后的产物，其抗氧化活性都存在着较明显的区别（P ＜0.05）。可能是由于100 ℃水煮只是单纯保持温度在100 ℃左右，而保持微沸的溶液其温度不仅是在100 ℃，而且溶液本身始终处于沸腾翻滚状态， 同样加速了溶液中的分子运动， 增大了黄芩粉末与水之间的接触机会，故而增加提取率。

3.2.2 提取时间对黄芩提取物抗氧化活性的影响由表5 可以发现，经过胃肠模拟消化后，不同时间对于DPPH 自由基清除率无显著影响（P ＞0.05）。总抗氧化能力、总还原能力、超氧阴离子清除率均是提取时间120 min 为最高， 但·OH 自由基清除率120 min 以35.36%居于第三，80 min 与60 min分别以36.60%、36.16%居于第一、第二，该指标较其他四个指标趋势并不一致， 故需要进行综合性分析才可得出相关结论。

表5 时间对黄芩提取液及其胃肠模拟消化后产物的抗氧化活性及秩和处理结果

将数据进行秩和处理后， 通过胃肠模拟消化产物的RSR 值分析可以确定， 提取时间为120 min 的提取液经过消化后综合抗氧化活性最高，140 min 次之。 故可以确定时间单因素试验中黄芩最佳提取时间为120 min。 随着提取时间的增加， 黄芩提取物抗氧化活性呈现先上升后下降的趋势，这可能是因为当提取时间较短时，提取效率高且有效物质未被破坏。但随着提取时间的延长，在60 ℃条件下提取溶液中含有的某些活性成分遭到破坏而失活，故其抗氧化活性呈现下降趋势。

3.2.3 液料比对黄芩提取物抗氧化活性的影响由表6 可以发现， 液料比单因素试验的显著性并不强，多数指标差异不显著（P ＞0.05）。 以胃肠模拟消化最终产物的抗氧化活性数据为主， 与不同的提取时间结果一样， 不同的液料比对于DPPH自由基清除率也无显著影响（P ＞0.05）。 但其余的四个指标中，均是以液料比50：1（mL/g）为最高， 分别是ABTS+自由基清除率38.47%、·OH 自由基清除率37.34%、总还原能力0.66、超氧阴离子清除率38.93%。

表6 液料比对黄芩提取液及其胃肠模拟消化后产物的抗氧化活性及秩和处理结果

通过秩和处理后，由表6 可知，通过胃肠模拟消化产物的RSR 值分析可以确定，经过消化后液料比为50：1（mL/g）的综合抗氧化活性最高。 故可以确定液料比单因素试验中黄芩最佳提取液料比为50：1（mL/g）。 对比试验结果可以发现，提取液料比并不是越大越好。 从液料比50：1（mL/g）到液料比60：1（mL/g）其抗氧化活性反而出现下降趋势， 出现这一现象的原因可能是提取液中发生了产物抑制， 当提取液中的活性物质趋近饱和或者过饱和状态时， 就会反向抑制更多有效物质的溶出， 并且此类抑制作用是无法通过增加底物浓度来解除的。

3.3 析因设计试验优化黄芩水提工艺结果 为了进一步提高黄芩提取物及其胃肠模拟消化后产物的抗氧化活性，在单因素试验结果的基础上，固定黄芩的提取温度即保持微沸， 对剩下的两个指标进行两两组合的析因设计，其结果如表7 所示。由表7 可知，不同的指标均呈现出相似的趋势，即从组合1 开始各指标数值均逐步攀升至组合4 时达到顶峰，再下降至组合6，然后继续攀升至组合9。 对各个指标进行综合的秩和处理后可以发现，组合4 为最佳的搭配组合：即提取温度保持微沸，提取时间120 min，液料比60：1（mL/g）。其经过消化后DPPH 自由基清除率为39.48%、ABTS+自由基清除率为58.85%、·OH 自由基清除率为48.63%、总还原能力为0.49、超氧阴离子清除率为28.87%。

对比前后单因素试验和析因试验结果可以发现，液料比有所出入。 单因素中为50：1（mL/g），而析因试验中为60：1（mL/g）。 其原因可能是，液料比单因素试验所采用的温度为60 ℃， 而析因试验采用的是保持微沸， 其水分蒸发量会多于单因素试验。 对比两者煮后的最终量可以发现，其两者均是（50±0.25）：1（mL/g），两者最终结果基本一致。

4 讨论

通过对比黄芩提取方式及冻干粉复溶后的抗氧化活性， 结果可知黄芩醇提物无论是醇提醇溶还是醇提水溶在经过体外胃肠模拟消化后， 其抗氧化活性均低于黄芩水提水溶。其原因可能是，黄芩的四种主要黄酮类成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素具有醇溶性，随着乙醇浓度的提高，其溶解度也会相应提高， 同时醇提可以抑制水提样品中像鞣质、蛋白、黏液等高分子杂质的溶解。但这些高分子杂质经过消化酶的作用， 可以被分解成小分子成分， 如蛋白被酶解成多肽从而获得相应的抗氧化活性（崔巍，2019）。故经过胃肠模拟消化后水提水溶的抗氧化活性会高于另外两组。

有研究证明， 黄芩的抗氧化活性主要是与其所含有的黄芩素和汉黄芩素有关， 通过加热或酶解作用均可以使黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷分解成苷元（高可新，2021），从而提高黄芩素和汉黄芩素含量。因此随着提取温度的升高，溶液的抗氧化活性也显著上升。另外黄芩苷存在着较强的极性，不易被人体肠道所吸收。 但黄芩苷容易被消化酶所水解，形成黄芩素，同时胆汁排泄在调节黄芩苷药代动力学中也起着关键作用（Zhang，2017；Kalapos，2015）。 所以在经过胃肠模拟消化后，黄芩溶液的整体抗氧化活性会普遍提升。

结合黄芩提取的单因素试验与析因试验，可以确定黄芩最佳提取工艺为水提法，优化后的提取参数为：保持微沸，提取时间120 min，液料比60：1（mL/g）。该提取工艺参数与利用响应面优化黄芩苷的水提工艺参数相近，说明黄芩的抗氧化活性仍与其所含的黄酮含量密切相关，其他大成分或许可以在消化酶的作用下水解成小分子而产生抗氧化活性，但不如黄芩本身所含的黄酮作用强。

为了使五种指标的结果在线性范围之内，本试验将不同的样品按不同的稀释倍数进行稀释，可以发现其稀释倍数由大到小均为：黄芩冻干粉复溶溶液、黄芩析因设计试验溶液、单因素试验溶液。其中黄芩析因设计试验溶液稀释倍数大于单因素试验溶液，可以说明其抗氧化活性在显著提升。 而黄芩冻干粉复溶溶液大于黄芩析因设计试验溶液的原因可能包括两方面： 一是制样原料加工方式不同，黄芩复溶溶液采用的是冻干粉，其是经过精制加工后才能获得，而单因素实验和析因设计试验仅仅采用黄芩水煮；二是活性物质含量不同，对比水提水溶组去除沉淀后和析因设计试验的组合4 溶液去除水分后， 其活性物质含量分别为0.0475 g/mL 和0.0071 g/mL，对比数据可以发现析因设计试验溶液的抗氧化活性高于水提水溶组。

5 结论

黄芩两种冻干粉在复溶、离心后，析出的沉淀量存在着明显差异。 对沉淀进行烘干去除水后称重，可以发现其析出的沉淀量多少为：水提水溶＜醇提水溶＜醇提醇溶；对这三组复溶溶液进行抗氧化指标测定，通过RSR 值的结果表明，其抗氧化活性大小为：水提水溶＞醇提水溶＞醇提醇溶。

在单因素试验中，相对于时间和液料比而言，温度对于提取过程的影响十分显著， 随着温度的升高，提取液的抗氧化活性也在升高。 通过RSR 值确定提取工艺为：温度保持微沸，提取时间120 min，液料比50：1（mL/g）。

通过析因设计试验分析各试验因素之间的交互作用，通过RSR 值确定析因设计试验的最佳提取工艺为：温度保持微沸，提取时间120 min，液料比60：1（mL/g）。

通过上述试验，可以得到具有高抗氧化活性的黄芩提取物， 其DPPH 自由基清除率为39.48%、ABTS+自由基清除率为58.85%、·OH 自由基清除率为48.63%、总还原能力为0.49、超氧阴离子清除率为28.87%。 本试验可为有效提取黄芩抗氧化活性成分及其在氧化应激反应中的作用提供参考依据。