高尿酸血症对雌性大鼠生殖功能的影响

宋淼,邹通,徐礼斌,龚雪琳,王笑峰,邢士超

(青岛大学,山东 青岛 266021 1 基础医学院病原生物学系; 2 口腔医学院)

尿酸是嘌呤代谢的终末产物。在我国,高尿酸血症(HUA)的患病率为13.3%,其中女性的患病率为7.9%[1-2]。近年来,女性不孕率不断升高,这与饮食、生活习惯和环境等因素密切相关[3]。研究表明,HUA与女性生殖障碍之间存在密切联系,但其机制尚不清楚[4-5]。在中枢神经系统中,亲吻肽(Kiss-peptin)通过调节促性腺激素释放激素(GnRH)影响下丘脑-垂体-性腺轴[6]。Kisspeptin蛋白由吻素1(KISS1)基因所编码,通过与吻素1受体(KISS1R)结合,发挥其生物学功能[7]。Kisspeptin和其受体KISS1R基因敲除的小鼠无正常的动情周期,且卵巢更小,存在生育困难[8-9]。本实验通过构建HUA雌性大鼠模型,观察雌鼠动情周期、器官湿质量系数、卵巢病理变化及卵巢组织中KISS1和KISS1RmRNA的表达,探究HUA对雌鼠生殖功能的影响。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康成年雌性Wistar大鼠14只,12周龄,体质量为(240±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。腺嘌呤(北京索莱宝生物科技有限公司);氧嗪酸钾(生工生物工程股份有限公司);质量分数为0.10的高酵母饲料(北京博泰宏达生物技术有限公司);毛细玻璃管(华西医科大学仪器厂);真空采血管(康卫仕医疗器械有限公司);低温离心机(赛默飞科技有限公司);PCR试剂盒(塞维尔生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组及处理 采用随机数字法将大鼠分为HUA组和对照组,每组7只。HUA造模参考李传伟等[10]的方法。HUA组大鼠饮食分为两个阶段:第1阶段,饲喂高酵母饲料,并且用40 g/L的腺嘌呤溶液按照100 mg/(kg·d)的剂量灌胃;在检测到大鼠血尿酸(SUA)水平显著下降时,进入第2阶段,继续饲喂高酵母饲料,腺嘌呤剂量减半,同时每日12:00给予大鼠腹腔注射氧嗪酸钾,用量为100 mg/(kg·d)。整个实验持续9周。对照组大鼠饲喂普通饲料,并且给予等体积的蒸馏水进行灌胃。两组大鼠均每间隔1周内眦取血0.5 mL,以3 500 r/min 离心10 min,取血清,采用生化分析仪检测SUA。

1.2.2动情周期观察 在确认造模成功后(第7周),每天8:00和20:00,抓取大鼠放置于手心,将沾有生理盐水的细小棉棒缓慢地插入大鼠阴道后稍停留,并轻轻旋转,缓慢地拔出,将阴道内含物均匀地涂抹在载玻片上,待自然干燥后,用亚甲蓝染色5 min,显微镜下观察。参考印丹丹等[11]的方法,根据细胞种类和比例的变化来判断动情周期,直至观察一个完整的动情周期。

1.2.3器官湿质量系数测定 在造模第9周后处死大鼠,留取完整的子宫、卵巢,吸干表面水分后称质量,计算器官系数。子宫(卵巢)系数=子宫(卵巢)质量(mg)/大鼠体质量(g)×100%。

1.2.4卵巢组织病理学观察 卵巢称质量后,取部分组织立即置于40 g/L甲醛中进行固定,制备组织蜡块,切片(5 μm),行苏木精-伊红(HE)染色,显微镜下观察。

1.2.5卵巢组织KISS1和KISS1RmRNA表达检测 剩余部分卵巢组织用trizol提取mRNA,逆转成为cDNA后,使用PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测。所用引物及其序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 PCR引物及其序列(5′→3′)

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 两组SUA水平比较

在模型构建第1、5、7、9周时,HUA组大鼠的SUA水平均显著高于对照组(F=9.430～28.910,P<0.05),表明HUA大鼠模型造模成功。见表2。

表2 两组大鼠SUA水平比较

2.2 两组动情周期比较

雌性大鼠动情周期可分为4个阶段。①动情前期:涂片可见大量有核上皮细胞和少量的角化上皮细胞(图1A);②动情期:涂片可见满视野的角化上皮细胞和少量的有核上皮细胞(图1B);③动情后期:涂片上有核上皮细胞、角化上皮细胞、白细胞均可见且比例相当(图1C);④动情间期:可见大量的白细胞和黏液(图1D)。与对照组相比,HUA组大鼠动情前期、动情期、动情后期时间无明显变化,而动情间期明显缩短(F=14.000,P<0.01)。见表3。

A:动情前期;B:动情期;C:动情后期;D:动情间期。亚甲蓝染色,200倍。

表3 两组大鼠动情周期比较

2.3 两组器官湿质量系数比较

与对照组相比,HUA组大鼠的子宫系数无明显变化,但卵巢系数显著下降(t=2.377,P<0.05),说明HUA对卵巢产生影响。见表4。

表4 两组器官湿质量系数比较

2.4 卵巢组织病理学观察

两组大鼠卵泡细胞的发育和成熟正常,病理切片无明显改变,说明HUA对卵巢组织没有明显破坏。见图2。

2.5 两组卵巢组织KISS1和KISS1R mRNA表达比较

qPCR检测结果显示,与对照组相比,HUA组大鼠卵巢组织中KISS1和KISS1RmRNA表达显著增高(t=3.456、5.408,P<0.05)。见表5。

表5 两组大鼠卵巢组织KISS1和KISS1R基因表达比较

3 讨 论

随着生活水平的提高,我国HUA发病率越来越高,女性发病率也呈现出逐年增长的趋势。尿酸不仅已经被证实是心血管疾病和高脂血症、糖尿病等代谢类疾病的风险因素[12],还与多种女性生殖障碍类疾病相关,如多囊卵巢综合征、子宫内膜异位、妊娠并发症等[5,13]。

在雌性哺乳动物中,动情周期分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期4个阶段。雌性大鼠体内的激素水平、卵巢和子宫的生理状态都随着动情周期的改变而变化,动情周期是雌性生殖健康的重要标志[14]。动情周期是由下丘脑-垂体-性腺轴所控制的,主要通过GnRH进行调节,主要有两种调节模式:一种是脉冲式分泌模式,负责刺激卵泡发育和类固醇生成;另一种则是激增分泌模式,主要负责诱导促黄体生成素的激增[15]。KISS1R是GnRH神经元脉冲式分泌活动调节的关键受体[16]。荀文娟等[17]研究发现,KISS1/KISS1R系统对猪的发情周期具有重要的调节作用。本文研究结果显示,与对照组相比较,HUA组大鼠卵巢组织中KISS1和KISS1RmRNA的表达水平均明显增高,尤其是KISS1RmRNA的表达增高更为显著。KISS1RmRNA编码的产物为Kisspeptin蛋白受体,本研究HUA组大鼠动情间期缩短,可能是由于KISS1R表达水平升高,使大鼠对激素更加敏感所致。

卵巢KISS1/KISS1R系统还控制着卵泡发育、卵母细胞成熟、调节排卵和卵巢类固醇激素的合成等[18]。FABOV等[19]研究发现,在卵巢的体外模型中,低剂量的Kisspeptin蛋白对卵巢有保护、抗凋亡的作用,而高剂量的Kisspeptin蛋白对卵巢具有负向调节作用。本研究HUA组大鼠卵巢组织中KISS1mRNA表达水平增高,但卵巢系数下降。猜测这可能是由于卵巢中Kisspeptin蛋白过量表达,卵巢功能被抑制所导致的。但目前尚缺乏直接证据与大规模的临床研究证实这一猜测。

综上所述,HUA可能通过KISS1系统导致雌性大鼠动情周期紊乱和卵巢系数下降,这为HUA的早期筛查及其并发症的预防性治疗提供了新的理论依据,也为女性生殖障碍相关疾病的诊疗提供了新的思路。