地黄不同炮制品指纹图谱模式识别及多成分含量测定

张丽先，魏 悦，李飞飞，李智宁，张桃桃

（1.河南省纳普生物技术有限公司，郑州 450000；2.河南省科学院天然产物重点实验室，郑州 450000）

地黄为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosaLibosch.）的新鲜或干燥块根。始载于《神农本草经》，列为上品，是著名的“四大怀药”之一［1］。鲜地黄清热生津、凉血止血，用于热病伤阴、舌绛烦渴等病症；生地黄清热凉血、养阴生津，用于热入营血、阴虚发热等病症；熟地黄补血滋阴、益精填髓，用于血虚萎黄、肝肾阴虚等病症［2］。鲜地黄、生地黄、熟地黄的化学成分不同，药性迥异，主要化学成分包括以梓醇为代表的环烯醚萜苷类、以毛蕊花糖苷为代表的苯乙醇苷类、以水苏糖为代表的低聚糖类等［3，4］。

2020 年版《中华人民共和国药典》中生地黄以梓醇和地黄苷D，熟地黄以地黄苷D 为质量控制指标，指标成分少，不能完整体现从鲜地黄到熟地黄炮制过程中化学成分的变化［2］。目前，对鲜地黄到熟地黄炮制过程中的研究集中在单一炮制过程或单指标成分，缺乏多指标成分全过程的研究［5-7］。本研究建立地黄不同炮制品的HPLC 指纹图谱分析方法，结合PCA和HCA模式识别方法分析鲜地黄、地黄片、生地黄、熟地黄之间的整体差异，同时对其中的环烯醚萜苷、苯乙醇类、核苷类11 种化合物含量进行测定，进而探究11 种化合物在炮制过程中的动态变化规律，以期为地黄不同炮制品质量评价提供新思路，为地黄药理药效及作用机制研究提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

腺苷（批号为110879-200202，纯度100%）、梓醇（批号为110808-201711，纯度99.6%）、毛蕊花糖苷（批号为111530-201914，纯度95.2%）购自中国食品药品检定研究院；尿苷（批号为19072210，纯度98.5%）、鸟苷（批号为19081902，纯度大于98.0%）购自成都普菲德生物技术有限公司；地黄苷D（批号为81720-08-3，纯度98.0%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；益母草苷（批号为BP0130，纯度98.0%）、密力特苷（批号为BP3251，纯度98.0%）购自成都普瑞法科技开发有限公司；焦地黄苯乙醇苷A（批号为PS012297，纯度98.0%）、焦地黄苯乙醇苷B（批号为PS000499，纯度97.0%）、异毛蕊花糖苷（批号为PS001059，纯度98.0%）购自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈为色谱纯，购自天津市四友精细化学品有限公司；乙酸为分析纯；水为娃哈哈纯净水。鲜地黄采自河南省温县、博爱县地黄种植区，生地黄、熟地黄由本实验室自行炮制，生地黄采用热风炉炮制，熟地黄采用酒蒸法炮制，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为玄参科植物地黄的新鲜或干燥块根，样品信息见表1。

表1 32 批地黄炮制品来源

1.2 仪器与设备

1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），ME 204 型电子天平（梅特勒·托利多仪器上海有限公司，精密度0.1 mg）；AUW 220D 天平（日本岛津公司，精密度0.01 mg）；DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-500E 型超声波清洗器（500 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Nucleodur C18 色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相由乙腈（A）和0.2%乙酸水溶液（B）组成，梯度洗脱见表2；检测波长：203 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量10 μL。

表2 HPLC 梯度洗脱程序

1.3.2 供试品溶液制备 鲜地黄粉碎，地黄片粉碎过2 号筛；生地黄、熟地黄切成约5 mm×5 mm 的小块，经80 ℃减压干燥24 h 后，磨成粗粉。精密称量鲜地黄（2.0 g）、生地黄（0.5 g）、熟地黄（0.5 g）、地黄片（0.5 g），用70%甲醇定容至50 mL，超声波提取30 min，70%甲醇补足减失的质量，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，得到鲜地黄、生地黄、熟地黄、地黄片的供试品溶液。70%甲醇溶液为阴性供试品溶液。

1.3.3 混合对照品溶液制备 分别称取对照品适量，精密称定，置于100 mL 棕色容量瓶中，以甲醇为溶剂，制得腺苷、尿苷、梓醇、鸟苷、地黄苷D、密力特苷、益母草苷、焦地黄苯乙醇苷A、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B、异毛蕊花糖苷11 种混合对照品溶液，质 量 浓 度 依 次 为109.05、78.23、2 231.00、15.11、207.42、65.36、164.45、23.27、12.33、21.26、15.74 mg/L。

1.3.4 线性关系考察 取混合对照品溶液，依次稀释1、2、5、10、25、50 倍，上机分析，对各成分质量浓度（μg/mL）和峰面积进行线性回归，回归曲线及线性范围见表3。

表3 11 种指标成分标准曲线

1.3.5 方法学考察 取混合对照品溶液，连续进样6 次，计算腺苷、尿苷、梓醇、鸟苷、地黄苷D、密力特苷、益母草苷、焦地黄苯乙醇苷A、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B、异毛蕊花糖苷11 种指标成分峰面积的相对标准偏差（RSD），以考察精密度。平行制备S1 号供试品溶液6 份，计算11 种指标成分百分含量的相对标准偏差，以考察重复性。取S1 号供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h 测定，计算11 种指标成分峰面积的相对标准偏差，以考察供试品溶液稳定性。取S1 样品6 份，分别精密称取0.25 g，置50 mL 容量瓶中，加入等量的11 种对照品，70%甲醇定容，超声波30 min，过膜，上机分析，计算11 种指标成分的平均回收率，以考察方法的准确性。

1.3.6 含量测定及指纹图谱数据采集 分析32 批地黄片、鲜地黄、生地黄、熟地黄样品溶液、混合对照品溶液及阴性供试品溶液（70%甲醇），采用外标法计算11 种指标成分含量。11 个指标成分中，梓醇、益母草苷、地黄苷D、密力特苷为环烯醚萜类化合物，毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷A、焦地黄苯乙醇苷B 为苯乙醇类化合物，腺苷、尿苷、鸟苷为核苷类化合物，这些成分的色谱峰响应较大，是地黄中主要的化学成分。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

由表4 可知，精密度考察结果中腺苷、尿苷、梓醇、鸟苷、地黄苷D、密力特苷、益母草苷、焦地黄苯乙醇苷A、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B、异毛蕊花糖苷11 种指标成分峰面积的相对标准偏差为0.72%~1.89%，表明仪器精密度良好。重复性考察中11 种指标成分百分含量的相对标准偏差为0.98%~2.94%，表明方法重复性良好。稳定性试验中11 种指标成分峰面积的相对标准偏差为0.79%~2.58%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。由表5 可知，加标回收率试验中11 种指标成分加标回收率为95.05%~102.56%，相对标准偏差为1.78%~3.45%，表明该方法准确可靠。

表5 加标回收率、相对标准偏差结果（单位：%）

2.2 指纹图谱相似度评价

鲜地黄（S9—S14）、地黄片（S1—S8）、生地黄（S15—S24）、熟地黄（S25—S32）HPLC 色谱图见图1、图2、图3、图4。依次将鲜地黄、地黄片、生地黄、熟地黄AIA 格式的色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A 版），利用中位数法，时间窗宽度设置0.1 min，通过多点校正，色谱峰匹配，生成鲜地黄、地黄片、生地黄、熟地黄的对照图谱，经计算，S1—S8 号地黄片图谱与对照图谱的相似度分别为0.987、0.995、0.976、0.978、0.954、0.989、0.985、0.985；S9—S14 号鲜地黄与对照图谱的相似度 分别 为0.995、0.995、0.969、0.976、0.996、0.998、S15—S24 号生地黄与对照图谱的相似度分别为0.953、0.980、0.975、0.973、0.938、0.894、0.988、0.991、0.983、0.961。S27—S32 号（不含S25、S26）熟地黄与对照图谱的相似度分别为0.986、0.987、0.902、0.978、0.923、0.986。

图1 地黄片HPLC 色谱

图3 生地黄HPLC 色谱

图4 熟地黄HPLC 色谱

2.3 色谱峰指认

经色谱峰匹配，北京三号地黄样品有28 个共有峰，指认了其中11 个共有峰（图5），1 为腺苷（5.62min）、2 为尿苷（6.24 min）、3 为梓醇（6.68 min）、4 为鸟苷（7.26 min）、5 为地黄苷D（9.47 min）、6 为密力特苷（9.69 min）、7 为益母草苷（11.56 min）、8 为焦地黄苯乙醇苷A（21.36 min）、9 为毛蕊花糖苷（23.05 min）、10 为焦地黄苯乙醇苷B（23.34min）、11 为异毛蕊花糖苷（24.27 min）。以3 号色谱峰为参照，1~11号色谱峰相对保留时间分别为0.841、0.934、1.000、1.087、1.410、1.451、1.731、3.198、3.451、3.488、3.633。

图5 北京三号鲜地黄、地黄片、生地黄、熟地黄、混合对照品及阴性供试品溶液色谱

2.4 主成分分析

PCA 是一种多变量统计方法，它是常用的降维方法，通过正交变换将原始数据转换为一组线性不相关的变量，提取数据的主要特征分量，转换后的变量被称为主成分，常用于高维数据的降维［8］。对32批样品数据进行主成分分析，PC1 和PC2 2 个主成分贡献率分别为36.29%、33.48%，累积贡献率为69.77%，能够概括样品数据的大部分信息。地黄片、鲜地黄、生地黄、熟地黄分别聚为4 类，如图6 所示，其中，生地黄样品类间差异较大，熟地黄明显区别于地黄片、鲜地黄、生地黄。

2.5 聚类分析

聚类分析是一种根据变量域之间的相似性而逐步归群成类的方法，它能客观地反映这些变量或区域之间的内在组合关系［9］。对32 批样品进行聚类分析，采用组间联接法聚类，以平方Euclidean 距离为指标，结果见图7。32 批样品聚为3 类，S1—S14号地黄片、鲜地黄样品聚为一类，生地黄（S15—S24）、熟地黄（S25—S32）各聚为一类，聚类结果与PCA 结果基本一致。

图7 32 批地黄样品聚类分析结果

2.6 多指标成分含量测定

阴性供试品溶液、北京三号鲜地黄、北京三号地黄片、北京三号生地黄、北京三号熟地黄及混合对照品色谱见图5，11 种指标成分外标法含量（n=3）计算结果见表6。分析同一产地同一品种地黄样品在炮制过程指标成分含量的变化，发现11 个指标成分变化规律各不相同，腺苷、尿苷在鲜地黄到熟地黄炮制过程中，含量整体呈增加趋势；梓醇在鲜地黄到熟地黄炮制过程中含量整体呈降低趋势，且变化明显；鸟苷在鲜地黄到生地黄炮制过程中整体呈增加趋势，在生地黄到熟地黄炮制过程中含量整体呈降低趋势；地黄苷D 变化不明显；密力特苷在生地黄中含量较高，熟地黄中含量较低；益母草苷在鲜地黄到生地黄炮制过程中含量变化不明显，在生地黄到熟地黄炮制过程中含量降低；焦地黄苯乙醇苷A 和焦地黄苯乙醇苷B 在炮制过程中含量处于动态变化中；毛蕊花糖苷在生地黄到熟地黄炮制过程中含量降低明显。

表6 32 批地黄不同炮制品中11 种指标成分的含量 （单位：%）

3 小结与讨论

3.1 提取条件优化

考察了30%、70%、100%甲醇为提取溶剂时的提取效率，选择70%甲醇为提取溶剂；考察了超声波、回流提取2 种提取方法，发现无显著差异，为操作便利，选择超声波提取；考察了10、30、60 min 提取时间，发现30 min 与60 min 色谱图无显著差异，为节约分析时间，提取时间选择30 min。

3.2 色谱条件优化

有机相为乙腈时，色谱峰分离效果优于甲醇；另外对比了0.1%乙酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%磷酸水溶液为水相时色谱峰分离效果，最终选择乙腈-0.2%乙酸水溶液为流动相；检测波长为203 nm时，11 个色谱峰响应值大于其他波长条件下的响应值，且基线平稳，分离度良好；再通过进一步优化洗脱程序，最终确定色谱条件。

3.3 指纹图谱分析

本试验建立的HPLC 指纹图谱结合了PCA、HCA 模式识别方法能较好地评估地黄从采收到炮制成品过程中的变化，不同地黄产品差异可通过PCA、HCA 结果直观地显现出来。PCA 结果中来自鲜地黄、地黄片、生地黄、熟地黄的32 批样品分为4类，熟地黄明显区别于地黄片、鲜地黄、生地黄，表明熟地黄与其他样品差异显著；HCA 结果中，当欧氏距离为5 时，32 批样品聚为3 类，鲜地黄和地黄片聚为一类，不同的模式识别方法之间有一定的差异，可根据具体情况选择合适的数据处理模式。

3.4 含量测定分析

在鲜地黄到熟地黄炮制过程中，环烯醚萜苷类成分梓醇含量较高，且在地黄不同炮制品中含量变化较大，初步推断梓醇可能是导致地黄不同入药形式差异的重要原因，其他环烯醚萜苷成分变化较小；核苷类成分整体呈增加趋势；苯乙醇苷类化合物含量较低，整体上含量呈降低趋势。