益气解毒化瘀方对溃疡性结肠炎大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响

查瑞瑶，李明，汪悦

安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是消化系统难治性疾病，好发于肠道黏膜层及黏膜下层，属于炎症性肠病范畴[1-2]，临床症状主要有腹痛、腹泻及黏液脓血便。研究发现，UC发病机制可能与免疫紊乱、凝血功能异常、肠黏膜屏障受损、肠道微生态改变等有关[3]。JAK2/STAT3信号通路是重要的细胞信号转导通路[4]，与UC发病密切相关。研究显示，UC细胞因子可能通过介导JAK/STAT信号通路调控T细胞分化，导致下游炎性因子“瀑布样释放”，进而损伤肠黏膜[5]。

益气解毒化瘀方是安徽中医药大学第一附属医院脾胃病科在多年临床经验基础上总结出的治疗UC有效方，认为UC发病以脾气虚弱为本，湿热内蕴为标，局部可能呈现血瘀的临床证变，故应用益气解毒化瘀为主要治法治疗UC，疗效显著[6]。前期动物实验显示，益气解毒化瘀方对UC大鼠免疫机制有调节作用，可降低UC大鼠炎症因子水平，修复肠黏膜屏障[7]。本研究从JAK2/STAT3信号通路出发，进一步研究益气解毒化瘀方调节UC大鼠免疫机制的作用机制，为中医药治疗UC提供新思路。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性大鼠60只，5～6月龄，体质量180～220 g，安徽省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（皖）2017-001。饲养于温度22～28 ℃、相对湿度50%～60%环境，自由摄食饮水。本实验经安徽中医药大学伦理委员会审批（AHUCM-2022066）。

1.2 药物及制备

益气解毒化瘀方由党参10 g、赤芍10 g、白芍10 g、煨木香10 g、薏苡仁30 g、白及10 g、麸炒白术10 g、三七粉5 g、马齿苋15 g、炒谷芽15 g、黄连2 g、黄柏10 g组成。饮片由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，除三七粉外，所有饮片常规浸泡、煎煮、过滤，药液加入三七粉混匀，旋转蒸发仪浓缩成每毫升含3 g原药材药液，置于4 ℃冰箱保存备用。柳氮磺吡啶片，0.25 g/片，批号20160702，上海三维制药有限公司。使用时去除外层包衣，研为细粉，用蒸馏水配制成40 mg/mL混悬液，置4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

5% 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批号P5632），德国Sigma公司；95%乙醇（批号100603），上海彤最化工科技有限公司；BSA（批号A602440-0050），生工生物工程（上海）股份有限公司；白细胞介素（IL）-6、IL-23、IL-17 ELISA试剂盒（批号均为20170312），安徽巧伊生物科技有限公司；维甲酸相关孤儿核受体γt（RORγt）抗体（货号bs-10647R）、信号传导与转录激活因子3（STAT3）抗体（货号bsm-33218M）、IL-6抗体（bs-0782R）、p-STAT3抗体（bs-1658R）、JAK2抗体（bs-23003R），北京博奥森；RIPA细胞裂解液（货号P0013B），上海碧云天；PVDF膜（货号IPVH00010），美国Millipore；PAGE胶促凝剂（货号T8090），北京Solarbio。自动曝光仪（型号JS-1070P，上海培清科技有限公司），转膜仪（型号VE-186，上海天能科技有限公司），常温微量离心机（型号LX 300，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），倒置显微镜（型号TS100-F，日本Nikon），酶标仪（型号iMark Microplate Reader，美国Bio-Rad）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药

60只大鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶组和益气解毒化瘀方低、中、高剂量组，每组10只。造模前大鼠禁食不禁水24 h，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将直径约1.5 mm的聚丙烯管插入肛门上端约8 cm，将TNBS原液0.2 mL/100 g加50%乙醇0.25 mL[8-9]，缓慢注入肠腔，提起大鼠尾部，倒置约30 s使造模剂充分接触肠腔。空白组予等体积生理盐水。造模第3日大鼠出现进食量减少、竖毛、懒动、黏液血便等表现，表明造模成功，剖腹摘取直肠和结肠，清洗后肉眼观察结肠水肿情况。

造模第4日开始给药，根据人与动物等效剂量换算法及前期经验[9-10]，益气解毒化瘀方低、中、高剂量组分别按人等效剂量的0.5、1、2倍灌胃益气解毒化瘀方药液（6.85、13.7、27.4 g/kg），柳氮磺吡啶组按0.4 g/kg灌胃，体积1 mL/100 g，正常组及模型组予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续2周。

2.2 标本采集

末次给药24 h后，脱颈椎法处死大鼠，腹主动脉采血，用于ELISA检测。取肛门至盲肠部结肠（约8 cm），沿肠系膜纵轴剪开，用冷生理盐水冲洗干净后平展于滤纸上，一部分用10%甲醛溶液固定，进行HE染色；剩余组织迅速置于离心管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot检测。

2.3 结肠组织形态观察

结肠组织用10%甲醛溶液固定后，常规脱水，浸蜡，透明，包埋，4 μm厚度切片，进行HE染色后观察结肠组织病理变化。

2.4 ELISA检测

取血后静置2 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA试剂盒测定IL-6、IL-23、IL-17含量，严格按说明书步骤操作。

2.5 Western blot检测

结肠组织用匀浆机破碎，加入裂解液提取总蛋白，使用10%分离胶进行蛋白电泳，转膜，脱脂牛奶封闭，加入IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt一抗（均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜5次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液，37 ℃孵育1～2 h，加入ECL发光液，化学发光检测器中曝光，以GAPDH为内参，Image J软件测量蛋白相对灰度值。

3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0统计软件进行分析。计量资料以表示，组间比较用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 益气解毒化瘀方对模型大鼠结肠组织病理变化的影响

空白组大鼠肠黏膜形态正常，无充血、水肿、糜烂、溃疡；模型组大鼠结肠黏膜可见溃疡形成，有大量炎性细胞和坏死细胞碎片，并伴有出血，累及黏膜下层，局部黏膜坏死，腺体结构紊乱、断裂；与模型组比较，各给药组炎性细胞浸润程度有所减轻，隐窝结构改变有所缓解，益气解毒化瘀方中、高剂量组和柳氮磺吡啶组改善效果更为明显。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织形态（HE染色，×200）

4.2 益气解毒化瘀方对模型大鼠血清白细胞介素-6、白细胞介素-17、白细胞介素-23含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23含量均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，益气解毒化瘀方中、高剂量组和柳氮磺吡啶组IL-6、IL-17含量显著减少（P＜0.05，P＜0.01），IL-23含量有所减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 各组大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23含量比较（，每组6只）

4.3 益气解毒化瘀方对模型大鼠结肠组织白细胞介素-6、Janus激酶2、信号传导及转录激活因子3、维甲酸相关孤儿核受体γt蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表达均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，益气解毒化瘀方中、高剂量组和柳氮磺吡啶组大鼠结肠组织IL-6、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图3。

图3 各组大鼠结肠组织IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表达比较（，每组6只）

5 讨论

JAK/STAT是一条由细胞因子刺激的多效级联反应信号通路，不仅参与细胞增殖、分化、凋亡，且在免疫系统发育和应答中发挥关键作用。Janus激酶（JAK）是一种酪氨酸蛋白激酶，目前发现JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2（Tyk2）共4个成员。STAT是一类能与靶基因调控区DNA结合的胞质蛋白家族，是JAK家族的直接下游底物[11-13]。STAT3位于IL-6通路下游，对Th17细胞的生成、分化至关重要。Th17细胞是CD4+效应T细胞的新亚型，可介导慢性炎症和自身免疫性疾病的发生，主要分泌IL-17、IL-21和IL-22等炎症因子[14-16]。Th17细胞的早期分化主要受转化生长因子（TGF）和IL-6的协同诱导，而已分化的Th17细胞存活及增殖则需IL-23刺激来维持，IL-23主要通过介导JAK/STAT信号通路上调IL-6等炎症因子表达，参与维持Th17细胞存活及增殖[17-19]。RORγt是控制Th17细胞分化的关键转录因子，诱导编码IL-17细胞因子基因表达[20]。

JAK/STAT信号通路除在细胞活动中发挥重要作用外，还与多种疾病的发病机制有关[21-23]。当肠道上皮细胞受到外界因子刺激时，前炎症因子刺激树突状细胞成熟并产生炎症因子如IL-6、IL-23等，炎症因子进一步与相应受体结合，导致受体发生二聚化或多聚化，使JAK1、JAK2磷酸化并激活STAT3，p-STAT3可上调转录因子RORγt表达，进一步促进Th17细胞分化，产生IL-17、IL-21、IL-22等，从而上调炎症因子水平，诱导肠道炎症反应，进而导致UC[24-26]。

益气解毒化瘀方由白头翁汤和芍药汤化裁而来，对UC具有一定的免疫调节作用。方中党参、麸炒白术、薏苡仁健脾益气，赤芍、白芍养血调血、柔肝止痛，三七、白及活血化瘀、止血去瘀，促进溃疡面愈合，马齿苋为治痢之良药，兼具清热解毒凉血之功，煨木香、黄连、黄芩共奏清热解毒、理气调中之功，炒谷芽调和诸药。全方具有益气健脾、活血化瘀、清热凉血解毒功效。本研究结果显示，模型组大鼠血清IL-6、IL-17、IL-23水平升高，结肠黏膜可见溃疡、出血及坏死，益气解毒化瘀方可降低UC大鼠血清IL-6、IL-17水平，改善结肠黏膜损伤。进一步研究发现，模型组大鼠结肠组织IL-6、JAK2、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表达显著升高，表明Th17细胞分化增多，产生大量炎症因子。经益气解毒化瘀方干预后，模型大鼠结肠组织IL-6、p-STAT3、STAT3、RORγt蛋白表达降低，说明JAK2/STAT3信号通路被抑制，炎症因子生成减少，炎症反应减轻，从而发挥治疗UC的作用。

综上，益气解毒化瘀方可通过调控JAK2/STAT3信号通路，降低炎症因子水平，减轻免疫炎症反应，发挥免疫调节作用。本研究可为中医药治疗UC提供实验依据。