结直肠癌中LC3与树突状细胞募集、TLS形成的相关性及其临床意义

武 寒，徐 磊，王苗苗，张睿哲，许晓阳，郭宁杰，吴淑华

滨州医学院附属医院病理科，山东 滨州 256600

随着生活环境及饮食习惯的改变，结直肠癌已发展为全球常见恶性肿瘤的第3位，居肿瘤相关死亡率的第4位［1］。因此，提高结直肠癌的疗效，改善其预后，是结直肠癌研究领域亟待解决的问题。肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤重要的生物学特性，目前抗肿瘤细胞免疫逃逸已成为肿瘤治疗的研究热点。有研究［2］已证实，伴有丰富三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure，TLS）的肿瘤组织对免疫治疗的反应率较高，提示TLS可以作为对肿瘤免疫治疗反应的预测因子。而成熟树突状细胞（mature dendritic cell，mDC）对肿瘤抗原的提呈作用则是促进TLS形成的关键［3］。自噬是细胞处理自身受损蛋白质和细胞器的重要生物学现象。本课题组前期研究［4］显示，结直肠癌中自噬可诱导肿瘤相关巨噬细胞募集及转化。本研究采用免疫组织化学EnVision法检测结直肠癌组织中自噬关键因子轻链3（light chain 3，LC3）的表达，并通过mDC、滤泡DC（follicular DC，FDC）、高内皮微静脉（high endothelial venule，HEV）及CD4+、CD8+、CD20+淋巴细胞的水平及Ki-67增殖指数判断TLS，采用蛋白质印迹法（Western blot）及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQP C R）检测L C 3、N Y-E S O-2、淋巴毒素β（lymphotoxin-beta，LTβ）、CC族趋化因子配体21（CC chemokine ligand 21，CCL21）、CXC族趋化因子配体13（CXC chemokine ligand 13，CXCL13）及白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）的表达，探讨自噬与mDC、TLS及相关免疫因子的关系，为进一步揭示结直肠癌肿瘤免疫逃逸机制、寻找新的治疗靶点及预测肿瘤免疫治疗效果提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本

收集2016年1月—2017年6月滨州医学院附属医院收治的经手术切除的T2期高危及T3期结直肠癌患者的临床病理学资料。所有病例均为首次发现，术前未经任何治疗，术后均采用FOLFOX方案化疗，并进行随访，随访截至2022年6月，失访者不予入组。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）第5版消化系统肿瘤分类标准［5］，由两名资深病理科医师双盲阅片重新诊断，非肿瘤死亡者予以排除。纳入结直肠癌患者179例，其中男性83例，女性96例，平均年龄61岁。组织学类型：管状腺癌143例，黏液腺癌36例。肿瘤直径＜5 cm者74例，≥5 cm者105例。分化程度：高分化26例，中分化98例，低分化55例。浸润深度：肌层65例，侵及或浸透外膜者114例。有淋巴结转移者90例，无淋巴结转移者89例。

1.1.2 试剂

LC3、DC-lamp、TLB、NY-ESO-2、CXCL13、CCL21、IL-17和β-actin抗体均购自英国Abcam公司，MECA-79抗体购自美国BD Biosciences公司，即用型抗体CD4 、CD8、CD20、CD21、Ki-67和羊抗兔/鼠Ⅱ抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Western blot检测所需试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，RTFQ-PCR实验试剂盒购自日本Takara公司，特异性引物序列由日本Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测

应用免疫组织化学EnVision法：3 μm连续组织切片，将切片脱蜡至水，用3%的H2O2去除内源性过氧化物酶，高压热修复抗原，加一抗LC3（1∶100）、DC-lamp（1∶500）、MECA-79（1：100）、即用型CD4、CD8、CD20、CD21、Ki-67抗体4 ℃过夜，二抗37 ℃温育30 min，采用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水透明，中性树胶封固。用已知LC3蛋白阳性的脑组织、DC-lamp蛋白阳性的肺组织、CD4蛋白阳性的T细胞淋巴瘤、CD8、CD20、CD21蛋白阳性、Ki-67增殖指数高的扁桃体组织作为阳性对照，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 免疫组织化学结果判定标准

LC3主要表达于肿瘤细胞的细胞膜或细胞质中，以出现棕黄色颗粒为阳性标志。选取10个阳性细胞数最多的高倍镜下视野，根据染色强度和阳性细胞所占比例判定结果：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数≤5%为0分，6% ～ 25%为1分，26% ～ 50%为2分，51% ～ 75%为3分，＞75%为4分。将两项评分结果相乘：≥4分判定为阳性，＜4分判定为阴性。

DC-lamp标记mDC主要表达于mDC细胞质中，每张切片在10倍镜下观察10个独立视野，选取5个阳性细胞数最多的视野，在高倍镜下计数，取平均值，高于平均值者为阳性，低于平均值者为阴性。CD4、CD8、CD20表达于淋巴细胞的细胞膜和细胞质中；CD21标记FDC表达于FDC细胞膜和细胞质中；MECA-79标记HEV表达于内皮细胞中，均以细胞膜和（或）细胞质内出现棕黄色为阳性标志。MECA-79+血管周环绕Ki-67+B细胞聚集区域判定为生发中心（germinal center，GC）。

根据结直肠癌中TLS的形态特征并辅以DClamp、CD4、CD8、CD20、CD21、Ki-67及MECA-79标记判定TLS［6］。观察肿瘤前沿10个低倍镜视野，根据有无TLS形成，将其分为TLS+和TLS-。并根据GC的形成进一步将TLS+分为：次级滤泡样TLS组（TLS/GC+，GC+及CD21+伴CD4+、CD8+、CD20+淋巴细胞聚集体形成，TLS计数≥1个）和初级滤泡样TLS和早期TLS组（TLS/GC-，GC-、CD21-/CD21+伴CD4+、CD8+、CD20+淋巴细胞聚集体形成，TLS计数≥1个）。TLS-样本根据淋巴细胞浸润量分为淋巴细胞弥漫组（diffuse lymphocytic infiltration，DLI；多量弥漫CD4+、CD8+、CD20+淋巴细胞浸润，无聚集体形成，淋巴细胞计数＞120个/高倍视野）和少淋巴细胞组（sparse infiltration，SLI；少量散在CD4+、CD8+、CD20+淋巴细胞分布，淋巴细胞计数＜120个/高倍视野）。本实验均采用同一样本连续切片进行上述各指标标记，并在同一视野下观察，以确保判读结果的准确性及组间可比 性。

1.2.3 Western blot检测

将新鲜组织经液氮冷冻研磨破碎后经放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解，12 000 r/min离心5 min提取上清液，采用二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，样品煮沸后进行电泳。应用含有吐温-20三乙醇胺缓冲盐溶液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗涤3次，每次15 min，5%的脱脂牛奶室温摇床封闭2 h；一抗4 ℃温育过夜；TBST洗涤3次，每次15 min；二抗室温温育2 h；TBST洗涤3次，每次15 min，电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）曝光，应用Image J软件对目标图像进行分析。

1.2.4 RTFQ-PCR

按照TRIzol试剂盒说明书提取组织RNA并检测其浓度，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s条件下将RNA反转录成cDNA。采用SYBR Green相对定量PCR法，按照试剂盒说明书配制25 μL体系反应液，在CFX96T RT-PCR Detection System C1000上进行扩增（表1）。反应条件：95 ℃ 30 s、95 ℃5 s、60 ℃ 30 s，合计40个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，实验重复3次，结果取平均值。

表1 RTFQ-PCR引物序列Tab. 1 RTFQ-PCR primer sequence

表2 结直肠癌与癌旁组织中LC3与DC-lamp的表达Tab. 2 The expression of LC3 and DC-lamp in colorectal cancer tissues and para-cancerous tissues

1.3 统计学处理

采用SPSS 27.0软件对数据进行统计学处理。运用GraphPad Prism 9.0及Image J软件进行图像和数据处理，组间比较采用配对t检验。计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率方法。相关性分析采用Spearman相关分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，并采用log-rank检验比较组间预后差异，采用COX比例风险回归模型进行多因素生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌中LC3和DC-lamp的表达及相关 性

采用免疫组织化学法检测LC3和DC-lamp的表达，结果显示，结直肠癌中LC3的阳性表达高于癌旁组，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，结直肠癌中DC-lamp的阳性表达高于癌旁组，差异有统计学意义（P＜0.05，图1，表 2）。

图1 结直肠癌与癌旁组织中LC3与DC-lamp的表达Fig. 1 The expression of LC3 and DC-lamp in colorectal cancer and para-cancerous tissues

根据LC3的表达将179例结直肠癌分为LC3+与LC3-组，分别计数DC-lamp+DC细胞。结果显示，LC3+组中DC-lamp表达高于LC3-组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Spearman相关分析显示，LC3表达水平与DC-lamp的表达呈正相关，差异有统计学意义（r= 0.237，P＜0.05，表3）。

表3 结直肠癌组织中LC3与DC-lamp表达的相关性Tab. 3 Correlation of LC3 and DC-lamp in colorectal cancer tissues

2.2 结直肠癌中TLS的功能亚型及占比

根据TLS判断标准，对179例结直肠癌患者进行分组。TLS+组115例，其中TLS/GC+亚型组40例（22.3%），TLS/GC-亚型组75例（41.9%）。TLS-组64例，其中DLI亚组33例（18.5%），SLI亚组31例（17.3%）。TLS+占比（64.2%）高于TLS-组（35.8%），详见图2。

图2 结直肠癌TLS/GC+、TLS/GC-亚型分组中各相关指标的表达Fig. 2 The expression of marker in TLS/GC+, TLS/GC- subtype in colorectal cancer

2.3 不同亚组结直肠癌中LC3的表达及相关性

观察各亚组中LC3的表达水平，分析其差异性及相关性。结果显示，TLS/GC+亚型组中LC3表达水平均明显高于其余3组，TLS/GC-亚型组中LC3表达水平则高于DLI组和SLI组，而SLI亚组中LC3表达水平明显低于其余3组，组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Spearman相关分析显示，LC3表达与TLS/GC+、TLS/GC-两亚型均呈正相关（r= 0.270，r= 0.230，P＜0.05），而与DLI、SLI均呈负相关（r= -0.175，r= -0.443，P＜0.05，表4，图3）。

图3 不同亚组结直肠癌组织中LC3与DC-lamp表达Fig. 3 The expression of LC3 and DC-lamp at different subgroups in colorectal cancer

表4 不同亚组结直肠癌中LC3的表达及相关性Tab. 4 The expression and correlation of LC3 at difffferent subgroups in colorectal cancer

2.4 不同亚组结直肠癌中DC-lamp的表达及相关性

在各亚组中分别计数DC-lamp+细胞。结果显示，TLS/GC+和TLS/GC-亚型组中DC-lamp的表达水平均高于其余两组，差异均有统计学意义（P＜0.05），但两亚组间比较DC-lamp的表达水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；而SLI组DC-lamp的表达水平均明显低于其余3组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Spearman相关分析显示，DC-lamp表达与TLS/GC+、TLS/GC-两亚型均呈正相关（r= 0.194，r= 0.227，P＜0.05），而与DLI、SLI均呈负相关（r= -0.148，r= -0.358，P＜0.05，表5）。

表5 不同亚组结直肠癌中DC-lamp的表达及相关性Tab. 5 The expression and correlation of DC-lamp in different subgroups in colorectal cancer

2.5 TLS+组与TLS-组中LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13、CCL21、IL-17的表达及结直肠癌中LC3与各因子的相关性

分别选取TLS+及TLS-结直肠癌组织各15例，检测LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13、CCL21及IL-17的表达。Western blot检测结果显示，TLS+组中LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13及CCL21的表达量均高于TLS-组，TLS-组中IL-17的表达量高于TLS+组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。RTFQ-PCR结果显示，TLS+组中LC3、NY-ESO-2、LTB、CXCL13及CCL21的mRNA表达量均高于TLS-组，TLS-组中IL-17 mRNA的表达量高于TLS+组，差异均有统计学意义（P＜0.05，图4A ～ 4C）。

图4 TLS+及TLS-组中LC3、NY-ESO-2、LTβ、CXCL13、CCL21、IL-17的表达及结直肠癌中LC3与各因子的相关性Fig. 4 The expression of LC3, NY-ESO-2, LTβ, CXCL13, CCL21 and IL-17 in TLS+ or TLS- groups and the correlation between LC3 and various factors in colorectal cancer

应用Image J软件进行图像处理，根据结直肠癌组织中各因子表达的灰度值，采用线性回归的对数趋势线分析其相关性。结果显示，结直肠癌组织中LC3与NY-ESO-2、LTβ、CXCL13和CCL21的表达均呈正相关（R2= 0.326、0.271、0.151和0.295），与IL-17的表达呈负相关（R2= -0.150），差异均有统计学意义（P＜0.05，图4D ～ 4H）。

2.6 生存分析

179例结直肠癌患者中的中位生存期为62个月，平均5年生存率为59.8%。Log-rank检验结果显示，LC3、DC-lamp、TLS及淋巴结转移与结直肠癌患者预后密切相关（P＜0.05，图5）。COX比例风险回归模型显示，LC3、DC-lamp、TLS及淋巴结转移是结直肠癌的独立危险因素（P＜0.05，表6）。

图5 结直肠癌患者的预后生存曲线Fig. 5 Prognostic survival curve in colorectal cancer patients

表6 影响结直肠癌患者预后多因素生存分析Tab. 6 Multivariable analysis of prognosis in patients with colorectal cancer

3 讨 论

自噬是一种高度保守的生物学行为，在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色［7］。自噬小体的成熟是自噬过程的关键阶段，它通过在细胞质中形成的双层膜结构包裹肿瘤相关抗原、免疫介质和表面标志物等待清除物质，形成自噬小体并运送到溶酶体中降解［8］。当这些物质被降解后，其中一部分抗原肽可以与MHC分子结合，形成MHC-抗原肽复合物，最终通过抗原提呈细胞呈递，从而激活免疫应答［8］。因此，自噬与抗原提呈的相关性受到广泛关注。Münz等［9］和Romao等［10］的研究表明，LC3-Ⅱ可以与MHC分子作用，从而影响抗原呈递的效率和选择性。Jin等［11］研究证实，雷帕霉素可通过与LC3融合，将抗原靶向自噬小体，有效地增强抗原提呈细胞中MHC-Ⅱ类分子上抗原的呈现。NY-ESO-2是肿瘤抗原中免疫原性最强的CTAG基因家族中的一员，但在结直肠癌中表达较低［12］。然而，本研究结果显示，在LC3高表达的结直肠癌中伴有肿瘤表面抗原NY-ESO-2高表达，且两者呈正相关。结合本课题组前期研究结果［13］，提示结直肠癌中存在自噬异常激活现象，并可增加肿瘤表面抗原暴露，进而影响肿瘤免疫。因此，深入研究自噬与肿瘤免疫的关系，对于肿瘤防治具有重要意义。

DC家族是免疫系统中功能强大的抗原提呈细胞［14］，其中mDC在抗原提呈中发挥关键作用，能够吞噬、摄取、内化和处理抗原，通过表面的共刺激分子与T细胞相互作用，使其激活并诱导增殖和分化［15-16］。Fridman等［17］研究发现，肿瘤细胞自噬小体作为mDC交叉递呈的抗原来源，可有效地提升诱导抗原特异性CD8+T细胞的应答能力。但也有研究［18］表明，高水平的自噬可导致MHC-Ⅰ类分子被选择性地降解，从而抑制T细胞介导的免疫反应，增加肿瘤细胞的免疫逃逸能力。Tian等［19］在肝癌细胞中研究发现，自噬活性升高会导致mDC中的氧化应激，并加速肿瘤抑制因子的降解，从而抑制其抗原提呈能力。由此可见，自噬与mDC抗原提呈诱导免疫的相关性还存在争议，而其在结直肠癌中的研究鲜见报道。本研究结果显示，LC3蛋白及mDC在结直肠癌中的表达率均明显高于癌旁黏膜，并且LC3表达与NY-ESO-2及mDC浸润量均呈正相关，提示结直肠癌中不仅存在自噬异常激活现象，同时也是增加肿瘤表面抗原暴露并最终影响mDC细胞浸润量及激活的重要因素。由此推测，结直肠癌中自噬所导致的肿瘤微环境中抗原的增加，可能是抗肿瘤免疫的始动因素之一，而mDC则在有效识别、呈递抗原、招募免疫细胞等方面发挥抗肿瘤免疫的核心效应。

TLS是位于非典型淋巴器官的异位淋巴结构［20］，常发生于各类肿瘤前沿。TLS的组成成分包括T细胞区、B细胞区和HEV。T细胞区主要由CD4+、CD8+T细胞及mDC构成，B细胞区由B细胞和FDC形成的GC构成［19］。TLS为抗肿瘤免疫反应提供了局部而关键的微环境［21］。目前研究发现，在胰腺导管癌［6］、乳腺癌［22］及非小细胞肺癌［23］等多钟实体肿瘤中均存在TLS结构，并且与肿瘤免疫及患者预后密切相关。Ding等［24］对肝内胆管癌的研究结果显示，TLS数量和空间位置与患者预后显著相关，证实肿瘤内TLS是抗肿瘤免疫反应的微观解剖学位点。Weinstein等［25］将转染过表达T-bet基因的mDC导入肿瘤微环境中可促进TLS发展、延缓肿瘤进程。Wang等［22］和Halle等［26］研究表明，mDC接受抗原刺激后通过产生多种细胞因子和趋化因子，在诱导免疫细胞异位聚集、促进FDC发育、构建TLS形态并维持其功能方面发挥重要作用。相关研究［27-28］表明，TLS/GC+亚型因具有成熟的GC，在维持肿瘤抗原特异性免疫反应方面具有最强效力，是最强抗肿瘤作用的“功能亚型”，TLS/GC-者次之，而缺乏TLS者的免疫监视能力较弱。有关结直肠癌中LC3与mDC对TLS功能亚型影响的相关研究较少。本研究的179例结直肠癌患者中有115例具有TLS结构，其中TLS/GC+亚型占22.3%，TLS/GC-亚型占41.9%，而DLI亚型占18.5%，SLI亚型占17.3%。本研究结果显示，TLS两亚型组中LC3表达水明显高于无TLS组，其中以TLS/GC+亚型组表达最高，并且LC3表达与TLS两功能亚型呈正相关。同时TLS两亚型组中mDC的表达高于其余组，且与功能亚型形成呈正相关。提示LC3激活mDC，通过招募淋巴细胞，促使TLS形成，在促进抗肿瘤免疫的功能中发挥重要作 用。

TLS对抗肿瘤免疫的积极作用已在结直肠癌［29］、乳腺癌［23］及非小细胞肺癌［24］等恶性肿瘤中被证实，因而诱导TLS形成已成为抗肿瘤研究的热点。目前，利用抗原呈递细胞、趋化因子或合成支架成为诱导TLS形成的主要方法［2］。因此，深入研究TLS的形成机制，对于寻找有效的促TLS形成途径具有重要意义。为进一步证实LC3、mDC与TLS的形成机制，本实验同步检测了CXCL13和CCL21以及LTβ、IL-17等部分细胞因子，并分析了上述因子与LC3的关系。结果显示，TLS+组中CXCL13与CCL21、LTβ呈高表达，而IL-17则表达较低。同时LC3与NY-ESO-2、LTβ、CXCL13及CCL21的表达均呈正相关，而与IL-17的表达呈负相关。提示LC3、mDC对TLS的影响机制可能是通过自噬促使NYESO-2等肿瘤表面抗原释放，进而激活mDC，而由mDC、FDC、T细胞产生的LTβ、CXCL13及CCL2等细胞因子的高表达在调控免疫细胞迁徙、归巢等方面发挥积极作用［24］，最终促使TLS形成，成为影响肿瘤免疫的重要因素。作为抑制自噬的促炎性细胞因子IL-17的低表达也在一定程度上推助了TLS的形成［30］。因此，结直肠癌的自噬水平可以成为影响TLS形成并向最强功能亚型发展的重要因素。由此推测，自噬的异常激活导致肿瘤表面抗原暴露增加，驱动mDC活化，促进抗原提呈，进而影响TLS发展与成熟，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。Dieu-Nosjean等［31］在早期非小细胞肺癌中发现mDC的密度及TLS的保护性免疫作用与良好的临床预后高度相关。Calderaro等［32］研究发现，肝细胞癌内TLS的存在与早期复发风险降低显著相关。本研究结果显示，具有TLS结构的115例（64.2%）结直肠癌患者的预后优于无TLS结构组，其5年存活率与既往研究［33］结果相符。COX比例风险回归模型显示，LC3、mDC、TLS及淋巴结转移是影响结直肠癌预后的独立危险因素，进一步证实TLS在一定程度上维持了免疫应答的中心环节。由此推测，在肿瘤微环境中，激活自噬，增强mDC抗原提呈，诱导TLS形成，有效激活T、B淋巴细胞，进而发挥抗肿瘤免疫作用，可能成为影响患者生存和预后的有效途径。

综上所述，结直肠癌的肿瘤细胞自噬水平的异常激活可使肿瘤抗原增加，肿瘤细胞表面抗原决定簇暴露，激活mDC，增加抗原识别及提呈能力，进而招募微环境中的淋巴细胞，最终形成TLS，通过多种细胞因子以增强抗肿瘤免疫反应，有效地避免肿瘤免疫逃逸现象的发生。深入探究自噬与mDC及TLS形成的关系，研究其在抗肿瘤免疫中的潜在作用，将有助于为发现肿瘤免疫治疗靶点提供新思路。然而本研究仅对结直肠癌中自噬与mDC对TLS的形成关系进行了初步探讨，仍需增加样本量并进一步开展实验研究，从而更深层次地揭示其分子机制及意义。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。