藻蓝蛋白粗提工艺研究

盛晶梦, 张祥霖, 尹 程

(安徽水利水电职业技术学院,安徽 合肥 231603)

蓝藻含有丰富的营养物质,其中藻蓝蛋白具有显著的资源化利用潜力。纯度越高价值也越高,通常可分为食品级(纯度≥0.7)、反应级(纯度≥3.9)和分析级(纯度≥4.0)三类[1]。藻蓝蛋白属于胞内蛋白质,藻细胞破碎后的溶液中除了藻蓝蛋白外还含有大量其他的蛋白质、多糖和脂质等物质[2],其提纯通常包括细胞破碎、粗提和纯化3个步骤,传统的方法有超滤法、盐析法、柱层析法等[3,4]。同时,一些新型的提纯方法如双水相萃取法、利凡诺沉淀法、活性炭吸附法等也为藻蓝蛋白的提纯拓宽了思路。藻蓝蛋白提纯技术的关键是在兼顾纯度和回收率的基础上探索多种方法的组合使用,以实现简化操作、缩减成本和缩短周期等目的。利凡诺是一种有机阳离子絮凝剂,在特定条件下通过控制其含量、pH等条件可以选择性的沉淀某些蛋白质[5]。而活性炭作为一种常见的吸附剂,在水处理中的使用也较多。2种方法所需要用到的仪器设备简单、操作性强且成本可控。因此,本文选择通过设置单因素及正交实验,探究这2种粗提方法的最佳工艺条件,为简化藻蓝蛋白提纯操作、实现蓝藻规模化处理和改善湖泊富营养化情况提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝藻:采用野外新鲜蓝藻藻泥(取自巢湖水域),藻体用清水洗净,然后密封放置于-4 ℃冰箱冷冻保存。

常用试剂:活性炭、HCl、NaOH、PBS缓冲液(浓度为0.002 5 mol/L)、利凡诺等。

1.2 分析方法

(1)藻蓝蛋白纯度(P)。用紫外可见光分光光度计测定蓝藻蛋白溶液吸光度(A)可发现,藻蓝蛋白在620 nm处有最大特征吸收峰,总蛋白则在280 nm处有最大吸收峰。由此可以参考Herrera等推荐的公式来计算藻蓝蛋白纯度。

(1)

其中,A280、A620分别为波长280 nm、620 nm处的吸光度。

(2)藻蓝蛋白回收率(Y)。先根据Soni等推荐的公式,计算出藻蓝蛋白的质量浓度(C),然后就可以得出藻蓝蛋白的回收率。

C=(A620-0.7×A280)/7.38

(2)

Y=(CV/C0V0)×100%

(3)

其中,C为样品中的藻蓝蛋白质量浓度;C0为粗提液中的藻蓝蛋白质量浓度;V为样品溶液的体积;V0为粗提液的体积。

1.3 蓝藻细胞破碎与初步处理

1.3.1 蓝藻细胞破碎

先将-4 ℃冷冻保存的蓝藻藻泥置于室温(25 ℃)下融解,再置于-4 ℃环境下冷冻,重复2次,完成蓝藻细胞冻融破壁操作。最后,用4层普通纱布滤去藻渣,即获得蓝藻细胞破壁液。

1.3.2 利凡诺与活性炭处理效果初步验证

将上一步所得蓝藻细胞破壁液取40 ml分成2组,分别进行如下操作,然后测量所得粗提液的吸光度,初步验证利凡诺与活性炭的处理效果:

第1组:向细胞破壁液中加入1 ml质量浓度为4 g/L的利凡诺溶液,搅拌均匀,于4 ℃条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度;然后,再加入1 g粉末活性炭,搅拌均匀,静置5 min后滤去沉淀,取上清液测量吸光度。

第2组:向细胞破壁液中先加入1 g粉末活性炭,搅拌均匀,静置5 min后滤去沉淀,取上清液测量吸光度;然后,再加入1 ml质量浓度为4 g/L的利凡诺溶液,搅拌均匀,于4 ℃条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度。

1.4 利凡诺处理单因素实验

通过单因素实验设计,分别考察不同利凡诺添加量和处理次数对于藻蓝蛋白粗提效果的影响。

1.4.1 利凡诺添加量对藻蓝蛋白提纯效果的影响

取步骤1.3.1所得蓝藻细胞破壁液120 ml,分成6组,向每组中分别加入质量浓度为4 g/L的利凡诺溶液0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml,搅拌均匀,于4 ℃条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度。

1.4.2 利凡诺处理次数对藻蓝蛋白提纯效果的影响

取步骤1.3.1所得蓝藻细胞破壁液100 ml,分成5组,分别进行如下操作:第1组向溶液中加入质量浓度为4 g/L的利凡诺溶液2 ml(步骤1.4.1中得出),搅拌均匀,于4 ℃条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度;第2组重复第1组的操作2次;后面各组以此类推…第5组重复第1组的操作5次。

1.5 活性炭处理单因素实验

取适量步骤1.3.1所得蓝藻细胞破壁液,按照步骤1.4所得利凡诺沉淀条件4 g/L的利凡诺溶液2 ml,处理2次)处理之后,通过活性炭单因素实验设计,分别考察不同粉末活性炭粒径、添加量对于藻蓝蛋白粗提效果的影响。

1.5.1 活性炭粒径对藻蓝蛋白提纯效果的影响

取上一步骤所得藻蓝蛋白粗提液100 ml,分成5组,向每组中分别加入粒径为Ⅰ(150 μm～75 μm),Ⅱ(75 μm～50 μm),Ⅲ(50 μm～38 μm),Ⅳ(38 μm～31 μm),Ⅴ(<31 μm)的粉末活性炭1.2 g,搅拌均匀,静置5 min后滤去沉淀测量吸光度。

1.5.2 活性炭添加量对藻蓝蛋白提纯效果的影响

取藻蓝蛋白粗提液120 ml,分成6组,向每组中分别加入粒径为75 μm～50 μm(步骤1.5.1中得出)的粉末活性炭,0.4 g、0.8 g、1.2 g、1.6 g、2.0 g、2.4 g,搅拌均匀,静置5 min后滤去沉淀测量吸光度。

1.6 藻蓝蛋白粗提处理正交实验

取步骤1.3.1制备的蓝藻细胞破壁液适量,根据单因素实验结果,选取利凡诺添加量、利凡诺处理次数和活性炭添加量3个因素设计L9(34)的正交实验进行研究,确定最佳粗提工艺参数。实验因素水平设置如表1所列。

表1 藻蓝蛋白粗提处理正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 蓝藻细胞破碎与初步处理

如图1所示,根据第一步操作结果可知,利凡诺和活性炭对于去除蓝藻细胞破壁液中的杂质、提升藻蓝蛋白纯度均有一定的效果,且粉末活性炭处理效果好于利凡诺。这可能是由于利凡诺作为絮凝剂,可以絮凝破壁液中的杂蛋白,降低总蛋白含量的同时使得藻蓝蛋白的比重增加;同时,活性炭的多孔结构对破壁液中的小分子有机物、杂质蛋白等都具有较好的吸附效果,而对于大分子的藻蓝蛋白则表现出一定的选择性,使得藻蓝蛋白的纯度大幅提升。根据第二步操作结果可知,利凡诺和粉末活性炭共同处理蓝藻细胞破壁液,藻蓝蛋白纯度可以进一步提升,而利凡诺沉淀处理与活性炭吸附处理操作的顺序先后对于最终提纯效果影响不大,考虑到利凡诺可以通过活性炭吸附去除,减少杂质的引入,所以选择先用利凡诺沉淀,然后用粉末活性炭吸附处理蓝藻细胞破壁液。

图1 利凡诺和活性炭对藻蓝蛋白提纯效果

2.2 利凡诺处理单因素实验

2.2.1 利凡诺添加量对藻蓝蛋白提纯效果的影响

如图2所示,利凡诺添加量对于藻蓝蛋白提纯效果的影响表现为,随着利凡诺添加量的增加,藻蓝蛋白的纯度总体呈上升趋势,而回收率则呈下降趋势。藻蓝蛋白的纯度在利凡诺添加量为0.5 ml～2.5 ml时明显增加,2.5 ml时达到峰值,2.5 ml～3 ml时开始有所下降。而藻蓝蛋白的回收率则在利凡诺添加量为0.5 ml～2 ml时缓慢下降,2 ml～3 ml时下降趋势明显变快。综合藻蓝蛋白的纯度和回收率两个因素,确定质量浓度为4 g/L的利凡诺溶液添加量为2 ml。

图2 利凡诺添加量对藻蓝蛋白提纯效果的影响

2.2.2 利凡诺处理次数对藻蓝蛋白提纯效果的影响

利凡诺处理次数对于藻蓝蛋白提纯效果的影响如图3所示,随着利凡诺沉淀操作次数的增加,总体上藻蓝蛋白的纯度呈缓慢上升的趋势,而回收率则缓慢下降。利凡诺沉淀次数在3次以内时,藻蓝蛋白的纯度增加趋势明显,而在第4次和第5次操作后,纯度增加不明显且有所下降。利凡诺沉淀次数在4次以内时,藻蓝蛋白的回收率下降趋势明显,之后则下降变缓。这可能是由于随着处理次数的增加,利凡诺在絮凝杂蛋白、提升藻蓝蛋白纯度的同时,也絮凝了部分藻蓝蛋白,使得总蛋白减少的同时藻蓝蛋白也有所减少。考虑到需要降低粗提操作的复杂性,并兼顾藻蓝蛋白回收率以保障后续提纯的效果,确定利凡诺处理次数为2次。

图3 利凡诺处理次数对藻蓝蛋白提纯效果的影响

2.3 活性炭处理单因素实验

2.3.1 活性炭粒径对藻蓝蛋白提纯效果的影响

活性炭粒径对于藻蓝蛋白提纯效果的影响,如图4所示,随着活性炭粒径的减小,藻蓝蛋白的纯度明显增加,回收率下降趋势则明显变陡。考虑到保障藻蓝蛋白回收率以满足后续提纯操作要求,确定活性炭粒径为75 μm～50 μm。

图4 活性炭粒径对藻蓝蛋白提纯效果的影响

2.3.2 活性炭添加量对藻蓝蛋白提纯效果的影响

活性炭添加量对于藻蓝蛋白提纯效果的影响,如图5所示,随着粉末活性炭添加量的增加,藻蓝蛋白纯度总体呈先增加后降低的趋势,而回收率则先缓慢降低然后迅速减少。在粉末活性炭添加量为0.4 g～1.2 g时,藻蓝蛋白纯度快速升高;1.2 g～20 g时,纯度增速变缓;2.0 g～2.4 g时,纯度开始降低。藻蓝蛋白的回收率在粉末活性炭添加量为0.4 g～1.2 g时缓慢降低,在1.2 g～2.4 g时迅速减少。这可能是由于,随着添加量的增加,活性炭吸附的小分子杂质逐渐增多,藻蓝蛋白大幅提升;同时,其孔隙中中孔和大孔的比重也在增大,对藻蓝蛋白的不可逆吸附逐渐增强,所以藻蓝蛋白的损失量也逐渐增多。综合藻蓝蛋白的纯度和回收率两个因素,确定粉末活性炭添加量为1.6 g。

图5 活性炭添加量对藻蓝蛋白提纯效果的影响

2.4 正交实验结果

根据单因素实验结果,选取利凡诺添加量、利凡诺处理次数和活性炭添加量3个因素设计L9(34)的正交实验,对结果用SPSS平台进行直观分析和方差分析,确定利凡诺与活性炭粗提蓝藻破壁液的最佳工艺条件。正交实验结果如表2～4所列。

表2 藻蓝蛋白粗提处理正交实验结果

由表3、表4的蓝藻破壁液粗提处理极差分析结果可知:

表3 藻蓝蛋白粗提处理纯度极差分析

表4 藻蓝蛋白粗提处理回收率极差分析

由于两个指标的最佳水平组合有所区别,所以需要对试验结果综合分析。对于粗提操作来说,无论是利凡诺处理还是活性炭处理,随着处理次数或试剂添加量的增加,藻蓝蛋白的纯度只能在一定程度内有所提高,回收率则会持续下降。粗提操作的目标主要是初步去除杂质,为后续的提纯操作打好基础,所以在追求提高纯度的同时更应注重藻蓝蛋白的回收率,避免藻蓝蛋白的总体产量不高。同时,粗提操作的次数、药剂添加的量也应优选更少的工艺。所以,本实验最终选定以藻蓝蛋白的回收率为优先考虑指标,在简化操作、缩短周期、降低成本的考虑下,确定最优工艺参数为:利凡诺添加量2 ml,处理次数为2次,活性炭添加量为1.2 g。

在上述蓝藻破壁液粗提操作最优工艺条件(利凡诺添加量为2 ml,处理次数为2次;活性炭粒径为75 μm～50 μm,添加量为1.2 g)下进行验证试验,结果表明:粗提处理后,藻蓝蛋白的纯度提升至1.67,回收率是61%。

3 结 论

由实验结果可知,利凡诺和活性炭对于藻蓝蛋白的提纯均有一定效果。且对单因素和正交实验结果分析可以得出,蓝藻破壁液粗提操作的最优工艺条件是利凡诺添加量为2 ml,处理次数为2次;活性炭粒径75 μm～50 μm,添加量为1.2 g。相比盐析、双水相、柱层析等提纯方法,本研究工艺所需设备简单、试剂较少、操作性强,易于规模化扩大,这为治理水体富营养化、进行蓝藻规模化处理开阔了思路。