3 种微生物制剂对黄芩白粉病的田间防效及叶片黄酮类成分的影响

张玲，何运转，孙占勤，李新畅，李海燕，张莹莹

（1.河北省承德市农林科学院，河北 承德 067000；2.河北农业大学植物保护学院，河北 保定 071000；3.围场满族蒙古族自治县农业农村局植保植检站，河北 承德 068450）

茶作为中国的传统饮品之一，具有悠久的历史文化和传统文化。而别样茶是指不属于山茶科来源的但广泛应用于民间作茶饮的植物[1]。其中传统中药黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）其地上部分的茎、叶在我国北方各省及云南部分地区一直作为代茶饮用，具有清热燥湿，泻火解毒，消炎等作用，又称为黄芩茶、黄金茶[2]。河北承德是道地黄芩主产区之一，有“热河黄芩”之美称。黄芩白粉病是黄芩生产常见病害之一，关于黄芩白粉病病原的研究，在90 年代初韩金声等[3]报道了二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.）。张海燕等[4]2010 年鉴定为蓼白粉菌（Erysiphe polygoni DC）。病害在黄芩成株期发生，主要侵害叶片，亦可为害果荚，严重时叶片干枯，对黄芩的质量和产量造成严重影响。目前，生产上仍以化学防控为主，对黄芩茶产业的安全生产造成一定威胁。因此探究环保、经济、安全的生物防治技术尤为重要。

目前，利用微生物及其代谢物防治植物病害已成为研究热点，但关于黄芩茎叶的研究主要集中在毒理学、药理活性成分及作用机制、代谢生物学、提取工艺等方面[5-9,10]，少量研究涉及到茎叶部分病害的化学药剂筛选方面[11,12]，未见黄芩叶部病害生物防治相关研究。本试验以黄芩叶部病害黄芩白粉病为研究对象，以黄芩中黄酮类成分为测定对象，比较3 种生物制剂对黄芩白粉病的防治效果及对叶部总黄酮类和黄芩苷药用成分含量的影响，以期为黄芩白粉病生物防控技术及黄芩资源的合理安全利用提供理论基础。

1 试验材料

1.1 试验材料及处理方法

供试作物为三年生道地黄芩，种子由承德市农林科学院药用动植物研究所提供。试验地在承德市隆化县中关镇大铺村承德市农林科学院科创基地进行。该地属于承德北部较温凉型农业气候区，平均海拔600～800 m，年平均气温4～8 ℃，年平均降水量450～600 mm，全年无霜期140 d 左右，≥10 ℃的有效积温2 000～3 200℃。试验地沙壤土，地势平坦，肥力中等。黄芩白粉病田间自然发病，白粉菌病原经形态学观察和生工生物工程（上海）有限公司测序后鉴定为二孢白粉菌，田间常规管理，不施用其他杀菌剂。

1.2 试验试剂

0.5 %几丁聚糖水剂（成都特普生物科技有限公司）；1 亿cfu/g 枯草芽孢杆菌微囊粒剂（成都特普生物科技有限公司）；10 亿个/mL（枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌）悬浮剂（云南省微生物发酵工程研究中心有限公司）；10%苯醚甲环唑水分散粒（先正达南通作物保护有限公司）。乙醇（优级纯，天津科密欧）；乙腈（HPLC 纯，美国Fisher 公司）；甲酸（LCMS 级，美国Anaqua Chemicals Supply 公司）；水（一级水，过Millipore 公司的Milli-Q Direct 8 过滤器）。

1.3 试验仪器

LC-20ADXR型高效液相色谱仪（Shimadzu公司，Japan），配有二极管阵列检测器；SB25-12DTD 超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司，China）；Milli-Q Direct 8 实验室纯水系统（Millipore 公司，USA）；T3 色谱柱（美国Waters Atlantis®T3，250 mm 4.6 mm，5μm）；0.22μm 有机系针头过滤器（天津市津腾实验设备有限公司，China）。

2 试验方法

2.1 田间药效试验

试验采用随机区组排列，每个小区面积20 m2，小区之间设保护行，3 次重复，黄芩白粉病田间自然发病。设5 个处理（药剂浓度按推荐剂量设定）。分别是处理1 为10 亿个/mL 解淀粉芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌悬浮剂300 倍液；处理2 为1 亿cfu/g 枯草芽孢杆菌微囊粒剂500 倍液；处理3 为0.5%几丁聚糖水剂500 倍液；处理4 为发病叶片（仅喷施清水），处理5 为10%苯醚甲环唑水分散粒剂。常规喷雾，喷药间隔为4d，共喷施2 次，试验期间不施用其他药剂。

在喷药前、喷药间隔期后进行白粉病病情调查。各小区随机调查3 点，每点调查5 株。每株选取东、南、西、北4 个方向上3 个分枝，每分枝自顶端向下选取10 片复叶，共计120 片复叶，于第1 次调查后标记所选定的分枝，第2 次继续调查。参照周天旺等[13]的方法，根据病斑面积占叶片比率进行分级。0 级：无病斑；1 级：病斑面积占整叶面积5%及以下；3 级：病斑面积占整叶面积6%～10%；5 级：病斑面积占整叶面积11%～25%；7 级：病斑面积占整叶面积26%～50%；9级：病斑面积占整叶面积50%以上。计算病情指数和防效，采用Excel、DPS 软件分析数据，采用邓肯氏新复极差法（SSR）分析处理间差异显著性。

式中：CK0为空白对照区施药前病情指数，CK1为空白对照区施药后病情指数，PT0为药剂处理区施药前病情指数，PT1为药剂处理区施药后病情指数。

2.2 叶片中黄酮类成分的变化

2.2.1 试验设计及材料 试验采用随机区组排列，每个小区面积20 m2，小区之间设保护行，3 次重复，黄芩白粉病田间自然发病。设5 个处理（药剂浓度按推荐剂量设定）。分别是处理1 为10 亿个/mL 解淀粉芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌悬浮剂300 倍液；处理2 为1 亿cfu/g枯草芽孢杆菌微囊粒剂500 倍液；处理3 为0.5%几丁聚糖水剂500 倍液；处理4 为发病叶片（仅喷施清水）；处理5 为未发病叶片（清水处理）。常规喷雾，喷药间隔为4 d，共喷施2 次。第2 次喷施制剂后第7 天自顶端完全展开复叶开始向下采集叶片，常温阴干，备用。

2.2.2 色谱条件 采用Waters Atlantis®T3（250 mm 4.6 mm,5μL。在该色谱条件下，样品和对照品中4 个黄酮类成分色谱峰均得到较好的分离，分离度＞1.5。混合供试品溶液和对照品溶液色谱图，见图1。

图1 高效液相色谱图谱Fig.1 Chromatogram of HPLC

图2 黄芩白粉病田间症状表现Fig.2 Field symptoms of powdery mildew

2.2.3 供试品溶液的制备 将已烘干的黄芩样品用粉碎机粉碎，过100 目筛，精密称取0.2 g，置于50 mL的离心管中，加入70%乙醇25 mL，超声30 min（功率200 W，频率40 kHz），9 000 r/min 离心10 min 后上清液倒入50 mL 容量瓶中，残渣再用70%乙醇20 mL，精密称定，超声30 min（功率200 W，频率40 kHz），9 000 r/min 离心10 min 后上清液合并到50 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容，混匀后取上清液用0.22μm有机滤膜滤过到2 mL 进样瓶，待液相色谱测定。

2.2.4 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，10 mg左右，分别用甲醇溶解并配制成1 mg/mL的标准品，作为标准品贮备液。依次吸取黄芩苷，汉黄芩苷，黄芩素，汉黄芩素标准贮备液各1 mL 都放置于50 mL 容量瓶中用甲醇定容，即得标准使用液，待液相色谱测定。并参照《中华人民共和国药典》要求进行了系统适应性试验。

3 结果分析

3.1 黄芩白粉病田间症状表现

根据田间调查结果，黄芩白粉病主要危害叶片和果荚。黄芩叶片正反两面均可发生白粉病，植株下部叶片最开始发病，发病初期叶片两面出现白色粉状圆斑，圆斑逐渐扩大，汇合成边缘不明显的大片白粉区，上面布满白色粉状物，严重时覆盖整个叶面，为病原菌的无性世代时期。进入9 月白粉层变为灰白色，粉层中初见橘黄色小颗粒，后变黑色，为病菌有性世代的闭囊壳。被病菌侵染的植株叶色发黄，焦枯至脱落，严重时全株枯死。

3.2 生物制剂对黄芩白粉病田间防效测定

由表1 可见，3 种生物制剂对黄芩白粉病均有良好的防治效果。第1 次喷药前，各处理病情指数在14～24 之间，第1 次用药后，各处理病情指数在8～10之间，10 亿个/mL（枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌）悬浮剂、1 亿cfu/g 枯草芽孢杆菌微胶囊粒剂防效均达60%以上，0.5%几丁聚糖水剂防效为54.4%，均低于化学药剂对照组10%苯醚甲环唑水分散粒剂防效81.21%。3 个生物制剂处理之间的防治效果差异均显著，且与化学药剂对照组差异极显著。10 亿个/mL（枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌）悬浮剂防治效果与其他两种生物制剂相比，差异极显著。

表1 3 种生物制剂对黄芩白粉病田间防治效果Table 1 Effect of three biological agents against powdery mildew in the field

表1 3 种生物制剂对黄芩白粉病田间防治效果Table 1 Effect of three biological agents against powdery mildew in the field

注：同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著（P ＜0.05），不同大写字母代表不同处理间差异极显著（P ＜0.01）。Note:Different small letters in the same column indicated significant differences between different treatments(P ＜0.05).Different capital letters indicated significant differences between different treatments(P ＜0.01).

第2 次用药调查结果显示，10 亿个/mL（枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌）悬浮剂防治效果达84.75%，且与其他两个生物制剂处理相比，差异极显著；1 亿cfu/g枯草芽孢杆菌微胶囊粒剂，0.5%几丁聚糖水剂防治效果均达70%以上，且2 个处理之间差异不显著。3 个生物制剂防效明显低于化学药剂对照组，差异极显著。且总体来看，复合菌制剂比单一菌制剂防控白粉病效果更佳。

3.3 生物制剂对黄芩叶中主要药用成分的影响

结果显示，经生物制剂处理后的叶片，其主要药用成分总黄酮和黄芩苷含量发生不同程度的变化。未发病叶片总黄酮含量为24.18 mg/g，发生白粉病植株叶片的病情指数为16.59 的情况下，总黄酮含量下降至18.18 mg/g，喷施两次生物制剂后，各处理总黄酮含量较发病叶片上升显著，但仍低于正常叶片中总黄酮含量。方差分析结果显示，10 亿个/mL（枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌）悬浮剂处理后，总黄酮含量23.25 mg/g高于其他2 种生物制剂，且与未发病叶片总黄酮含量相比差异不显著，与其他处理差异显著。喷施1亿cfu/g枯草芽孢杆菌微胶囊粒剂和0.5%几丁聚糖水剂后，总黄酮含量21.79 mg/g、21.22 mg/g 高于发病叶片但低于正常叶片，两处理间差异不显著，与其他处理相比差异显著。未发病叶片黄芩苷含量为0.26 mg/g，发病后植株叶片黄芩苷含量下降至0.17 mg/g，喷施2 次生物制剂后，各处理黄芩苷含量上升显著。黄芩苷含量由高到低的处理排列顺序为10 亿个/mL（草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌）悬浮剂处理（黄芩苷含量1.01 mg/g），其次是1 亿cfu/g 枯草芽孢杆菌微胶囊粒剂处理（黄芩苷含量0.83 mg/g），再次是0.5%几丁聚糖水剂处理（黄芩苷含量0.61 mg/g），3 个处理黄芩苷含量均高于未发病叶片，且3 个处理间、3 个处理与未发病叶片间差异均显著，见表2。

4 讨论与结论

4.1 生物制剂对黄芩白粉病田间防效分析

芽孢杆菌属革兰氏阳性细菌，是防治植物病害最有前途的常规农药替代品，可产生多种活性物质促进植物生长，诱导植物自身抗性，抑制多种植物病害，通过竞争空间和营养成分对微生物病原体造成拮抗作用[14]。几丁聚糖是我国第一个登记为植物诱抗剂的生物农药，通过激活植物免疫系统与生长系统来增强植物的抗逆性，还具有促进生长、形成保水薄膜等作用[15]。研究表明，这3 种生物制剂对黄芩白粉病菌均有良好的抑制作用，施用2 次后，1 亿cfu/g 枯草芽孢杆菌微胶囊粒剂、0.5%几丁聚糖水剂防治效果均达70%以上，10亿个/mL（枯草芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌）悬浮剂防治效果最好，达84.75%。研究发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是通过产生脂肽类、胞外蛋白、聚酮化合物、抗菌多肽等多种抗菌物质对植物病菌产生明显的抑制作用[16,17]。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种典型的植物生长促生菌，定殖植物组织后可产生与植物细胞和根系生长相关的激素和挥发性有机物质，促进植物获取养分[18-20]。可能由于解淀粉芽孢杆菌的促生长作用，加强了植物发病组织的愈合能力，与枯草芽孢杆菌共同作用，较单一菌株作用下植物抗逆性显著增强，防治效果明显提升。

4.2 生物制剂对黄芩叶中主要药用成分的影响

黄芩叶片中黄酮类化学成分主要是野黄芩苷、野黄芩素、芹菜素7-O--D-葡萄糖醛酸苷及白杨素7-O--D-葡萄糖醛酸苷等[10,21,22]。采用HPLC 法对黄芩不同部位及其茶制品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 这5 种黄酮类成分进行比较，测得黄芩叶中只含有黄芩苷[21]，且其含量很低。黄芩叶部HPLC 指纹图谱也仅指认出该5 种黄酮类成分中黄芩苷色谱峰[22]。黄芩苷是黄芩素在黄酮类7-O-葡萄糖醛酸基转移酶（UBGAT）的催化下生成的。黄芩中黄酮代谢途径不仅受内部基因的调控，还受外部因素的影响。其中诱导子（生物诱导子和非生物诱导子）可调控黄芩中活性黄酮的积累，促进次生代谢产物的积累。有研究发现，茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）能够通过上调黄酮合成途径相关基因从而促进黄芩悬浮细胞、愈伤组织和发根中黄芩苷的积累。一定浓度的水杨酸会抑制黄芩愈伤组织生长，但能促进黄芩苷的积累。黄芩愈伤组织培养基添加外源植物激素如6-苄氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9H-purin-6-amine,6-BA]和萘乙酸（1-naphthylaceticacid,NAA），也能够提高黄芩苷含量[10]。本研究发现植物诱抗剂、微生物次生代谢物可提高黄芩白粉病发病叶片中总黄酮类成分及黄芩苷的含量，喷施制剂后总黄酮类成分含量未恢复到正常叶片水平，黄芩苷含量较正常叶片有显著提升。相比总黄酮类成分，黄芩苷合成路径更易受到这些代谢物的影响，黄酮类和黄芩苷合成路径的代谢物种类及其调控作用方式还有待进一步研究。