两种玉竹根茎显微形态及同工酶谱带比对研究

吴杰，宁伟

（1.沈阳医学院公共卫生学院，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 110161）

玉竹[Polygonatum odoratum(Mill.)Druce]为百合科黄精属多年生草本植物，其根茎的应用历史久远。玉竹性微寒，味甘，有养阴润燥、生津止渴之功效[1-3]。据现代药理研究，玉竹中主要化学成分为多糖类化合物，玉竹具有提高人体免疫力、强心、降血脂、降血糖及延长动物寿命等作用[4-6]。在我国玉竹主要有南北两大产区[7]，本研究选择北方辽宁省宽甸县主产区的宽甸玉竹和湖南新邵县玉竹药材基地主产区的邵县玉竹为实验材料，具有栽培药材的道地代表性。现对两类玉竹品种的显微结构和POD 同工酶谱带进行比对，分析宽甸玉竹与邵县玉竹显微结构和POD同工酶谱带差异，进而来区分南北玉竹结构差异及遗传特性，为进一步开发利用玉竹资源奠定理论基础，同时也为进一步开发玉竹成分提供理论依据。

1 试验材料与仪器

1.1 主要仪器

试验仪器为OLYMPUS 台式显微镜（BH 型，日本奥林巴斯），高速冰冻离心机（TGL-16EI，山东博科），电泳仪（DYCZ-24DN型，北京六一），垂直平板电泳槽（JY-SCZ2 型，北京六一），40 W日光灯具一套（上海灯具厂），酸度计（上海仪器仪表有限公司），Brand 移液器（德国普兰德）等。

1.2 材料与药品

1.2.1 材料 宽甸玉竹新鲜根茎来源于辽宁省丹东市宽甸县玉竹生产基地，称为宽甸玉竹（属于关玉竹中一种）；邵县玉竹新鲜根茎来源于湖南新邵县玉竹药材基地，称为邵县玉竹（属于湘玉竹中一种）；两种中药玉竹均为市场常见药材，具有药材可比性。

1.2.2 药品 FAA 固定液（50%～70%酒精90 mL，37%～40%甲醛水溶液5 mL，冰醋酸5 mL）；二甲苯、酒精、石蜡（48～50 ℃）、明胶、染色液0.5%～1%的番红酒精（70%酒精）+0.1%～0.2%的固绿酒精（95%酒精）、加拿大树胶、5 mol/L磷酸缓冲液、Tris、四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、核黄素、盐酸、甘氨酸、联苯胺、醋酸、EDTA-Na、氯化铵、双氧水（以上试剂均为分析试剂，购自沈阳国药）。

2 试验方法

2.1 宽甸玉竹与邵县玉竹根茎石蜡切片观察

试验取材为宽甸玉竹与邵县玉竹1 年生新鲜根茎进行石蜡切片观察。利用常规石蜡切片与番红－固绿对染法，其步骤为固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→粘片→脱蜡→复水→番红、固绿染色→封藏。切片厚度为10μm，用加拿大树胶封片，BH 型OLYMPUS 显微镜观察并照相[8]。

2.2 宽甸玉竹与邵县玉竹POD同工酶检测

2.2.1 酶液的制备 将采收的宽甸玉竹根茎与购买的邵县玉竹新鲜根茎用蒸馏水洗净并吸干水分，各称取0.5 g 根茎于研钵中，用0.5×10-2mol/L 磷酸缓冲液pH 7.8 在冰浴中研磨匀浆，并定容至5 mL，在4 ℃下以13 000 g 离心20 min，取上清液即为酶粗提液。

2.2.2 电泳 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为10%（pH 8.9），浓缩胶浓度（pH 6.7），电极缓冲液为pH 8.3 的Tris 每孔点样量为40μL，加入2 滴溴酚蓝指示电泳前沿。于4 ℃冰箱内恒压电泳，浓缩胶中为112V，待指示剂进入分离胶后增大至210V，电泳约需4 h。

2.2.3 染色 过氧化物同工酶染色用醋酸 联苯胺染色法染色。经染色胶版上出现棕褐色清晰酶带，用蒸馏水漂洗后置7.5%冰醋酸中脱色、固定、照相和作图。按Rf=酶带迁移距离/指示剂迁移距离记录Rf 值。并利用SPSS 19.1.1 软件进行数据分析[6]。

3 试验结果

3.1 玉竹形态学观察结果

从宽甸玉竹与邵县玉竹根茎的表面形态学观察可以看出，新鲜的宽甸玉竹根茎相对较细且颜色为白色，而邵县玉竹根茎较粗且颜色为棕黄色。宽甸玉竹与邵县玉竹的根茎均为圆柱形，且有分支，但宽甸玉竹的表面玉白色或淡白色，直径均值为0.5～1.6 cm，节明显，节间距平均值为3.5～9.6 cm，而邵县玉竹直径均值为1.2～4.7 cm，节明显，节间距平均值为5.3～11.4 cm。一般宽甸玉竹根茎比邵县玉竹根茎细小，且宽甸玉竹颜色较浅，分支较邵县玉竹的多且粗，多呈分支状，而邵县玉竹的多为须根状，见图1。

图1 宽甸玉竹和邵县玉竹1～3 年生根茎比对图Fig.1 Comparison of 1～3 year roots and stems of Kuandian and Shaoxian

3.2 玉竹根茎的石蜡切片观察

3.2.1 玉竹根茎石蜡切片结果 基于宽甸玉竹与邵县玉竹形态学的明显差异，进一步对其显微结构进行观察，石蜡切片观察结果表明，宽甸玉竹的表皮厚度平均为2.24×10-2mm；薄壁组织厚度平均为8.69×10-2mm；微管组织厚度平均为1.561mm；邵县玉竹的表皮厚度平均为3.85×10-2mm；薄壁组织厚度平均为5.36×10-2mm；微管组织厚度平均为3.114 mm，见图2。

图2 宽甸玉竹和邵县玉竹根茎石蜡切片横纵切面Fig.2 Transverse and longitudinal section of paraffin section of rhizome of Kuandian and Shaoxian

试验基于宽甸玉竹与邵县玉竹根茎形态学存在很大差异的基础上，对宽甸玉竹与邵县玉竹根茎进行显微形态学石蜡切片的观察，目的是为了观察确定宽甸玉竹与邵县玉竹的形成层主要结构，分为表皮、薄壁组织和微管组织，宽甸玉竹与邵县玉竹的新鲜根茎的主要显微形态学结构基本一致，这与宽甸玉竹和邵县玉竹的本身生长特性相符合。

3.2.2 玉竹根茎石蜡切片显著性分析 由上述玉竹新鲜根茎石蜡切片观察测定结果进行宽甸玉竹与邵县玉竹种间的表皮、薄壁组织和微管组织进行差异显著性的方差分析，进一步为判断宽甸玉竹与邵县玉竹种间的差异显著性提供可靠依据，其方差分析结果表明，宽甸玉竹与邵县玉竹种间石蜡切片结构表皮、薄壁组织和微管组织结构间均存在显著差异，见表1。

表1 宽甸玉竹与邵县玉竹石蜡切片结构方差分析Table 1 Anova of paraffin section structure of Kuandian and Shaoxian

表1 宽甸玉竹与邵县玉竹石蜡切片结构方差分析Table 1 Anova of paraffin section structure of Kuandian and Shaoxian

注：**代表极显著差异。Note:**Represents a very significant difference.

3.3 玉竹POD同工酶谱带分析

试验基于对宽甸玉竹与邵县玉竹根茎形态学和显微结构观察的基础上，进一步对其POD 同工酶电泳谱带进行检测，以达到区分鉴定宽甸玉竹与邵县玉竹分类学地位的目的，其POD 谱带，见图3。

图3 宽甸玉竹与邵县玉竹POD 同工酶电泳谱带及模式图Fig.3 POD isozyme electrophoretic bands and patterns of Kuandian and Shaoxian

由图3 可以看出，宽甸玉竹与邵县玉竹的过氧化物同工酶谱带从负极到正极共分离出4 条谱带，且所有谱带的Rf 值都小于0.5。宽甸玉竹与邵县玉竹过氧化物（POD）同工酶谱带相似度达80%以上，但是宽甸玉竹的过氧化物同工酶谱带在Rf=0.03 与Rf=0.16时谱带颜色很浅淡，而相同Rf 值时邵县玉竹谱带颜色很深，说明宽甸玉竹中的某些蛋白含量低于邵县玉竹。

4 讨论

4.1 宽甸玉竹与邵县玉竹显微结构区别显著

在《中国植物志》上描述玉竹，分布于欧亚大陆的温带，变异甚大，叶下面脉上和花丝均可平滑至具乳头状突起，不同作者对不同类型曾给予不同等级的名称，由于对它的变异规律尚未十分掌握，我们在植物志中，对它的种下等级不再细分[10-15]。本研究采用具有南北区域代表性的宽甸玉竹（属于关玉竹中的一种）和邵县玉竹（属于湘玉竹中一种），且这两种玉竹均是大量销售于河北安国和安徽亳州的主要玉竹品种。因此，本研究受药材企业委托，将这南北两大主产区中药玉竹根茎进行比对研究，我们跟踪3 年，分别采集1 年生、2年生和3 年生玉竹根茎进行形态学比对，并进行同工酶图谱比对。针对《中国植物志》中玉竹种属分类问题的混淆，我们主要开展以药产地为依托的中药材形态学比对工作，因此可忽略中间分类问题的混淆。本试验对宽甸玉竹与邵县玉竹形态学进行比对，结果表明新鲜的宽甸玉竹根茎相对较细且颜色为白色，而邵县玉竹根茎较粗且颜色为棕黄色。宽甸玉竹与邵县玉竹的根茎均为圆柱形，且有分支。但宽甸玉竹直径均值为0.5～1.6 cm，节明显，节间距平均值为3.5～9.6 cm；邵县玉竹直径均值为1.2～4.7 cm，节明显，节间距平均值为5.3～11.4 cm。

本研究在对宽甸玉竹和邵县玉竹新鲜根茎横切面和纵切面石蜡切片观察的基础上进行其显微结构分析鉴定，结果显示宽甸玉竹与邵县玉竹的切片结构一致，均有表皮、薄壁组织和微管组织组成。结果表明，宽甸玉竹的表皮和薄壁组织结构比邵县玉竹的厚且相对疏松，而微管组织比邵县玉竹的薄且致密，且均存在极显著差异，这主要是由于宽甸玉竹与邵县玉竹的种间差异和生长环境条件不同所导致的。邵县玉竹相对于宽甸玉竹而言，其结构微管组织相对较厚，且组织细胞较密，细胞间隙相对较小，这也符合邵县玉竹比宽甸玉竹粗壮坚硬的特性[16-18]。

4.2 宽甸玉竹与邵县玉竹同工酶谱带比对

由于宽甸玉竹与邵县玉竹在形态上就存在着一些差异，且同工酶是编码基因不同而产生的多种分子结构的酶，基因的微小变化都会引起同工酶的变化[19,20]。因此，可从同工酶谱的变化及酶谱特征了解品种间的种间差异，但仅凭同工酶图谱尚无法证明其种间亲缘关系。应该综合考虑AFLP、SSR、ISSR 和PARD 等分子标记研究结果，来进行玉竹种间亲缘关系鉴定。本试验说明了宽甸玉竹与邵县玉竹之间的品种，属于同一种属植物，存在的差异为种内遗传多样性差异。

本研究对于宽甸玉竹与邵县玉竹的石蜡切片显微结构观察和POD 同工酶电泳谱带分析技术进行分类学地位鉴定，并确定二者之间的亲缘关系，得出宽甸玉竹与邵县玉竹为同一种属植物但存在一定的种内差异。这主要因为宽甸玉竹与邵县玉竹生长产地的地域性差距形成了不同的生态居群，环境原因是造成宽甸玉竹与邵县玉竹形态结构及同工酶电泳谱带不同的根本原因。本研究为中药玉竹产地分类提供理论基础，也为进一步开发利用中药玉竹资源提供理论依据。