基于网络药理学和分子对接技术探讨桂枝茯苓丸治疗肝硬化的作用机制

杨石磊，黄峰※，晁旭，冯雪松

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学基础医学院病理学教研室，陕西 咸阳 712046；3.陕西中医药大学基础医学院生物化学教研室，陕西 咸阳 712046）

肝硬化是肝纤维化的最终阶段，是众多慢性肝病转归的重要节点。全世界每年约有200 万人因各类肝病而死亡，这其中又有约100 万人死于肝硬化导致的诸如大出血、腹水等并发症，如今肝硬化是排在全球第11 位最常见的死亡原因，给人类健康带来巨大威胁[1]。目前，西医对于肝硬化的治疗并不理想，主要是病因治疗，晚期治疗的唯一选择只有肝移植[2]。中医药在治疗肝硬化方面具有独特优势，已有临床研究显示[3]，既往是否联合中医药治疗，是影响肝硬化预后转归的重要因素。此外，研究显示[4]，中医药在降低肝硬化患者肝癌发生率、提高肝硬化患者5 年生存率和预防肝硬化食管胃静脉曲张破裂出血等方面具有显著疗效。从中医角度来看，肝硬化可以按癥瘕积聚、肿胀和黄疸等来论治[5]，病机为血瘀络阻，在治疗上，应重视活血化瘀通络[6]。桂枝茯苓丸是《金匮要略》中的经典名方，有活血化瘀、缓消癥块之功，原方主要用于治疗妇女瘀阻胞宫诸症。根据中医“方证相应”理论以及肝硬化的临床表现，肝硬化的病机和症候都符合桂枝茯苓丸的方证要点[7]。赵玉瑶等[8]以桂枝茯苓丸为基础方治疗代偿期肝硬化32 例，取得良好效果，但目前缺少大样本临床研究，且机制尚不明确。

网络药理学综合了计算机信息学与系统生物学，从药物－靶点－疾病－基因层次来解释药物对疾病的作用机制，这与中药复方治疗疾病的多成分、多靶点理论有异曲同工之处，十分符合中医“异病同治”、“同病异治”的观点[9]。分子对接技术可以进一步对筛选后的核心成分与核心靶点进行验证，以评估两者的结合潜力。因此，本研究采用网络药理学与分子对接的方法，分析桂枝茯苓丸的有效成分，预测潜在作用靶点，探讨其在治疗肝硬化中的潜在机制，为后续的研究提供初步理论基础。

1 资料与方法

1.1 桂枝茯苓丸中活性成分与靶点的收集

选取TCMSP（https://tcmspw.com/index.php ）[10]、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）[11]和HERB（http://herb.ac.cn/）[12]等多个数据库，分别以桂枝、茯苓、桃仁、赤芍和牡丹皮为关键词检索获取桂枝茯苓丸中的活性成分，再进行数据合并以及去除重复项；并以口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%、类药性（Drug-likeness,DL）≥0.18 为条件[13]筛选活性成分。先用TCMSP 数据库对活性成分的作用靶点进行预测，若该数据库中某活性成分无对应靶点，再用ETCM 与HERB 数据库进行补充。将收集到的靶点用UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）设定“Reviewed”和“Human”为限定条件，对该靶点所对应的基因名称进行标准化处理[14]。

1.2 肝硬化疾病靶点收集

以“cirrhosis”为关键词，分别在Genecards（https://www.genecards.org/）[15]、OMIM（https://www.omim.org/）[16]和TTD（http://db.idrblab.net/web/）[17]疾病基因数据库进行检索，将检索结果利用EXCEL 合并后去除重复值。

1.3 药物－疾病共有靶点筛选

将桂枝茯苓丸活性成分靶点与肝硬化疾病取交集靶点，构建Venn 图（http：//www.bioinformatics.com.cn/），得到桂枝茯苓丸治疗肝硬化的靶点。

1.4 构建活性成分－靶点网络及分析

运用Cytoscape 3.9.1[18]构建桂枝茯苓丸“活性成分－靶点”网络和分析，利用其内置Network Analyzer分析工具分析网络具体数据，包括连接度（Degree）、紧密度（Closeness centrality,CC）和介度（Betweenness centrality,BC）等，研究药物活性成分与其靶点之间的关系。

1.5 靶蛋白相互作用网络图构建

利用STRING（https://cn.string-db.org/）[19]数据库，将物种设定为Homo sapiens，并设置minimum required interaction score ＞0.70，删除游离作用靶点，构建蛋白相互作用网络（PPI）。再将后台数据下载，利用Cytoscape 3.9.1 处理，得到桂枝茯苓丸治疗肝硬化潜在靶点蛋白相互作用可视图。

1.6 生物信息学分析

将所获得的交集靶点录入Metascape 数据平台（https：//metascape.org）[20]，将条件设置为P<0.01，进行GO 功能分析与KEGG 通路富集分析，保存后台结果，并用微生信分析平台（http：//www.bioinform atics.com.cn）对后台结果进行可视化分析。

1.7 分子对接

选择在桂枝茯苓丸“活性成分－靶点”网络中degree排名前6 位的核心活性成分，以及PPI 网络中degree排名前6位的靶点基因分别进行分子对接。从PubChem数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取核心活性成分小分子配体2D 结构，再转化为3D 结构并另存为SDF 格式，随后利用Open Babel 3.1.1 通过MMFF94 力场优化小分子能量，将SDF 转化为PDB格式，最终通过AutoDock Tools 1.5.7[21]得到核心活性成分的PDBQT 格式文件。从PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）[22]获取PPI 网络中相互作用靶点基因的3D 结构，用Discovery Studio 2021 去除小分子配体及水分子，得到靶点基因的PDBQT 格式文件。利用AutoDock Tools1.5.7 将上述得到的结果进行分子对接验证，最终对接结果用Discovery Studio 2021 进行可视化处理。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸活性成分与靶点筛选

综合多个数据库，共获得桂枝茯苓丸有效成分56个，其中桂枝、茯苓、桃仁、赤芍和牡丹皮分别有4、12、16、14 和6 个特有成分；以及茯苓和桃仁共有成分1个，桂枝、桃仁和赤芍共有成分1 个，桂枝、赤芍和牡丹皮共有成分2 个（表1）。通过TCMSP 数据库共获得作用靶点638 个，其中桂枝74 个、茯苓30 个、桃仁139个、赤芍158 个和牡丹皮237 个。结合ETCM、HERB数据库进行补充，共收集到桂枝茯苓丸中活性成分的相关作用靶点690 个。再利用Uniprot 数据库进行基因统一标准化处理，并经过EXCEL 合并去重后，最终获得桂枝茯苓丸中活性成分的标准基因靶点270 个。

表1 桂枝茯苓丸有效成份Table 1 Guizhifuling Pill active ingredient

2.2 肝硬化疾病靶点

通过GeneCards数据库获得肝硬化疾病靶点5224个，将其Relevancescore利用EXCEL通过2 次MEDIAN（中位数）函数筛选后获得靶点1 305 个。OMIM 数据库获得靶点10 个，TTD数据库获得肝硬化靶点5 个。利用EXCEL 合并、去除重复靶点，最终获得1 309 个肝硬化疾病靶点。

2.3 桂枝茯苓丸活性成分与肝硬化共有靶点

将桂枝茯苓丸活性成分的270 个靶点与肝硬化的1 309 个疾病靶点通过Venn 图取交集，共获得共有靶点121 个，这些靶点可以视为桂枝茯苓丸治疗肝硬化的关键靶点，见图1。

图1 桂枝茯苓丸活性成分与肝硬化的交集靶点Venn 图Fig.1 Venn diagram of the intersecting targets of the active ingredients of Guizhifuling Pill and liver cirrhosis

2.4 桂枝茯苓丸“活性成分-靶点”网络构建和分析

运用Cytoscape 3.9.1 构建桂枝茯苓丸活性成分与其作用靶点网络，图中包含331 个节点，753 条边，六边形节点代表药物活性成分，菱形节点代表作用靶点；若节点越大、透明度越低，则说明其degree（连接度）越大，见图2。再将活性成分具体数据利用EXCEL根据连接度进行排名，并综合紧密度（Closenesscentrality,CC）与介度（Betweennesscentrality,BC）进行分析，最终得到综合排名前10 的药物活性成分节点为MDP01、B1、FL12、MDP03、A1、CS05、CS01、B3、CS02 和B2，见表2。

图2 桂枝茯苓丸“活性成分－靶点”网络图Fig.2 Guizhifuling Pill"active ingredient-target"network

表2 桂枝茯苓丸核心活性成分Table 2 Guizhifuling Pill core active ingredients

2.5 蛋白质相互作用网络构建

将桂枝茯苓丸活性成分与肝硬化疾病共有的121个靶点采用STRING 数据库构建PPI 网络。网络中包含121 个节点和845 条边，平均degree 值为14。再将数据导入Cytoscape 3.9.1 进行处理并形成可视化分析图，其中若节点越大、颜色越深，则说明其degree（连接度）越大，在网络中的作用也就越重要（图3）。按degree 由高到低排序，排名前12 的靶点基因依次为：TNF、AKT1、TP53、IL6、CASP3、RELA、IL1B、EGFR、MYC、VEGFA、MMP9 和MAPK1，这些基因可能在桂枝茯苓丸治疗肝硬化的机制中具有关键意义。

图3 桂枝茯苓丸治疗肝硬化PPI 网络Fig.3 Guizhifuling Pill for cirrhosis PPI network

2.6 生物信息学分析

利用Metascape 数据平台对桂枝茯苓丸治疗肝硬化的121 个核心靶点进行GO 富集分析。以P<0.01为条件，得出前10 条在生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）的条目，并作柱状图（图4）。桂枝茯苓丸治疗肝硬化在生物过程中主要涉及对活性氧的反应、对脂多糖的反应和对细菌来源分子的反应等，在细胞组成上主要涉及窖蛋白、质膜筏和膜筏等，在分子功能上主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性、转录核心调节器结合等，表明其分布于各种生物过程、分子组成与分子功能中。

图4 桂枝茯苓丸治疗肝硬化靶点GO 功能分析柱状图Fig.4 Histogram of GO function analysis of Guizhifuling Pill for cirrhosis

利用Metascape 数据平台以P<0.01 为条件，根据KEGG 代谢通路富集分析结果，按P 值排序，获得排名前20 条通路的气泡图，气泡颜色代表P 值的大小，颜色越红则P 值越小，气泡大小表示通路中基因的数量，气泡越大则基因数量越多（图5）。并将前20条通路与其基因数据利用Cytoscape 3.9.1 进行可视化分析，得到通路－靶点网络图，圆形节点代表通路，菱形节点代表基因靶点。节点越大、透明度越低，说明其degree（连接度）越大（图6）。最终得出桂枝茯苓丸治疗肝硬化主要富集的通路为癌症中的途径、脂质和动脉硬化途径、AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化途径、乙型肝炎途径、前列腺癌途径、丙型肝炎途径、人类巨细胞病毒感染途径、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒感染途径、小细胞肺癌途径、TNF 信号通路、IL-17 信号通路、麻疹途径、非酒精性脂肪肝途径、胰腺癌途径、化学致癌-受体激活途径、恰加斯病途径、甲型流感途径、结核病途径和弓形虫病途径，表明桂枝茯苓丸的有效成分靶点通过调节不同通路对肝硬化起到治疗作用。

图5 桂枝茯苓丸治疗肝硬化靶点KEGG 富集分析气泡图Fig.5 Bubble map of KEGG enrichment analysis of the target of Guizhifuling Pill for the cirrhosis

图6 桂枝茯苓丸治疗肝硬化前20 条通路与其靶点基因网络图Fig.6 The first 20 pathways of Guizhifuling Pill for cirrhosis and its target gene network

2.7 分子对接

选取桂枝茯苓丸中排名前6 位的活性成分：槲皮素、β-谷甾醇、脱氢尿酸、山柰酚、常春藤皂苷元、黄芩素与PPI网络中排名前6 位的靶点基因：TNF、AKT1、TP53、IL6、CASP3PRELA 分别进行分子对接，具体数据见表3。分子对接结合能数据用热图进行展示，结果见图7。若对接结合能越低，则代表活性成分与靶点基因结合结构越稳定，两者之间相互作用的可能性也就越大。对接结果显示，β-谷甾醇与AKT1、常春藤皂苷元与AKT1、脱氢尿酸与AKT1、黄芩素与AKT1 的对接结合能均小于 38 kJ/mol。其中，β-谷甾醇与AKT1的对接结合能仅为 45.61 kJ/mol，在36 组中最低，提示桂枝茯苓丸中的活性成分β-谷甾醇可能通过作用于AKT1 起到治疗肝硬化的作用。将分子对接结合能最低的4 组结果作分子对接图，见图8。

图7 活性成分与靶点基因对接结果热图Fig.7 Heat map of the docking results of active ingredients and potential targets

图8 分子对接图Fig.8 Molecular docking maps

表3 关键活性分子与靶点对接表Table 3 Docking of key active molecules and targets

3 讨论

网络药理学可以初步揭示中药方剂治疗特定疾病的潜在作用机制。本研究通过网络药理学与分子对接的方法对桂枝茯苓丸的活性成分进行分析，得出连接度排名靠前的活性成分主要有槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素和(+)-儿茶素等，这些活性成分可能是桂枝茯苓丸治疗肝硬化的核心活性化合物。其中，槲皮素可以通过调节细胞色素C 参与细胞凋亡途径[23]，具有保肝、护肝功能，并且已有动物试验表明其可能通过抑制TLR4/CXCL9/PREX-2 通路缓解肝硬化进程[24]。Kim 等[25]发现，β-谷甾醇可通过减轻肝脏组织中胶原的累积以预防肝纤维化向肝硬化进一步转变，而β-谷甾醇为桂枝茯苓丸中桂枝、赤芍和桃仁3 药共有成分，更进一步证明了桂枝茯苓丸对肝硬化的治疗作用。黄芩素已被证明在体外试验中有抗肝纤维化作用[26]，Dong等[27]研究显示，黄芩素可通过下调PERK 蛋白和上调Nrf2蛋白起到减轻肝脏氧化应激和细胞凋亡的作用。儿茶素及其衍生物可以通过调控MAPK、NF-κB 信号通路等发挥抗炎、保肝作用[28]，越来越多的研究证实，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及其下游信号在肝硬化疾病中起着重要调控作用[29]，而NF-κB 信号通路又是肝硬化发展过程中的重要信号通路。(+)-儿茶素为桂枝、赤芍和牡丹皮3 种药共有成分，在酒精性脂肪肝动物模型中，(+)-儿茶素通过促进超氧化物歧化酶（SOD）的表达，以减少血清中甘油三酯与转氨酶含量，最终修复小鼠的肝脏损伤[30]。

通过PPI 得出桂枝茯苓丸治疗肝硬化的靶点基因有肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）、蛋白激酶1（Protein kinase 1,AKT1）、白细胞介素6（Interleukin 6,IL6）、天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase 3,CASP3）、血管内皮细胞生长因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1）等。TNF-α和IL-6 是具有协同作用的促炎症因子，已被证实是乙肝患者向肝硬化进展的关键因素[31]。肝脏细胞凋亡与CASP3 的活性有着密切关系，TNF/TNFR1 复合物可以激活CASP3 的下游因子，这对肝硬化的进展具有重要影响[32]。AKT是PI3K信号通路的下游因子，PI3K信号通路可激活多种炎症反应，进而通过炎症反应参与肝硬化的发生[33]。从图7 中可看出，在36 组分子对接验证中，AKT 与6 个核心活性成分的对接结合能均小于 38 kJ/mol，显示出较强的结合活性，为深入挖掘桂枝茯苓丸治疗肝硬化的作用机制提供了方向。血管生成在慢性肝病中起着重要作用，肝星状细胞可以通过表达VEGFA 诱导血管生成[34]，从而促进肝硬化进程。MAPK1 作为MAPK 家族成员之一，具有调节肝脏细胞增殖、分化及死亡的功能，可以通过影响炎性细胞黏附血管内皮增殖促进肝硬化的发生[35]。

通过分析KEGG 代谢通路富集得出的排名前20条的通路，在排除与肝硬化明显不相关的通路后，发现AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路或IL-17 信号通路可能是桂枝茯苓丸治疗肝硬化的潜在信号通路。研究显示[36]，AGE 可与RAGE 结合，作用于NF-κB信号通路，引起IL-1 等炎性因子产生，促进肝脏中纤维化因子形成与胶原蛋白累积，逐步由肝纤维化发展为肝硬化。在TNF 信号通路相关机制研究中，尽管TNF-α会促进肝硬化的发展程度，但在特定浓度下，TNF-α对四氯化碳诱导的急性肝损伤有明显的保护作用，其作用机制可能与TNF-α进一步激活了Bcl-XL、FHC、XIAP 和Bcl-2 等抗凋亡基因有关[37]，TNF 信号通路的双重作用仍需进一步研究。有临床观察发现，与健康者相比，肝硬化患者的血清中IL-17 明显增高，并且IL-17 水平与患者的转氨酶水平呈正相关关系[38]。IL-17 信号通路可以通过上调p38MAPK 和ERK 1/2的方式促进IL-6 产生[39]，或激活STAT 3 信号通路直接诱导肝星状细胞产生Ⅰ型胶原[40]。综上所述，桂枝茯苓丸可通过作用于多个靶点并通过多种机制和调节多条信号通路发挥其抗肝硬化的作用。

4 结语

本研究为进一步挖掘桂枝茯苓丸治疗肝硬化的作用机制提供了一定的理论依据。目前，研究缺少对桂枝茯苓丸治疗肝硬化的直接报道，仍多集中于其他活血化瘀类方剂以及其5 味中药组成所含化学成分的作用研究，这反映出对桂枝茯苓丸的挖掘并不够深入及全面。利用网络药理学方法研究中药方剂治疗特定疾病的作用机制仍有一定的局限性，如现有药物、疾病数据库收录信息不全等，本文的研究结果仍处于理论阶段，还需与临床及药理试验相结合进行深入研究。