工业酶催化剂构建与反应过程强化新技术

栾鹏仟，冯玉晓，卢滇楠，蒋国强，刘 铮，戈 钧

(清华大学化学工程系工业生物催化教育部重点实验室，北京 100084)

生物催化剂作为一种绿色天然催化剂，推动了化学工业可持续发展。与传统的化学催化相比，生物催化具有反应速率快、(立体、化学、区域)选择性高等优势[1-2]。然而，目前两个关键的瓶颈阻碍了酶催化在工业上的规模化应用：一是天然酶的稳定性不足，难以在工业要求的环境下长期维持活性；二是天然酶催化的反应类型较为受限，许多反应难以找到匹配的酶来进行催化[3-5]。

借助纳米材料对酶分子进行固定化，能够改善天然酶的稳定性和重复使用性，使其满足工业应用的要求[6-7]。利用催化功能丰富的金属原子对天然酶进行改造，构建酶-金属复合催化剂，能够赋予酶新的催化活性，达到拓展酶催化反应类型的效果[8-9]。经过十几年的研究，研究者们根据不同天然酶的需求，设计开发了一系列高活性、高稳定性、高重复使用性的固定化酶方案，建立了酶-金属复合催化剂的设计方法，并构建了一系列具有级联催化性能的酶-金属复合催化剂。

本文重点介绍酶纳米凝胶、酶-无机纳米晶体复合物和酶-金属复合催化剂方面的研究进展，并分析探讨该领域在未来发展中所面临的问题与挑战。

1 酶纳米凝胶

利用载体固定化天然酶虽然能够提升其稳定性，但同时也会妨碍酶构象的转变和底物与产物的传输，导致酶分子不能展现出应有的活性。Yan等[10]对辣根过氧化物酶(HRP)进行表面丙烯酰化，赋予酶表面更多的乙烯基，获得酶-高分子配合物；随后在丙烯酰胺、交联剂和引发剂的作用下，在室温进行纳米凝胶的原位水相聚合(图1(a))，制备的纳米凝胶具有很好的可渗透性，且证实每个凝胶中只含有一个酶-高分子络合物，封装率高达92%。同时发现，固定化前后催化剂的Kcat与km基本没有发生变化，巧妙地解决了载体带来的传质问题。在稳定性方面，纳米凝胶封装的单酶具有更好的热稳定性和溶剂耐受性，在60 ℃缓冲溶液中处理90 min或在60 ℃的甲醇溶液中处理10 min，纳米凝胶封装的酶活能维持在80%以上，而天然酶的活性基本已丧失。在此基础上，Wang等[11]结合底物印迹技术，在凝胶中加入底物分子，冷冻干燥后通过有机溶剂萃取掉底物分子，成功将印迹结构固定在凝胶层内部，结果发现，利用该方法显著提高了纳米凝胶对底物的亲和性，与未印迹的酶分子纳米凝胶相比，表观活性提高了40%。

图1 酶纳米凝胶与酶氧化石墨烯气凝胶的构建与反应过程强化Fig.1 Construction and reaction process enhancement of enzyme nanogel and enzyme graphene oxide aerogel

与传统的液相酶催化相比，气相酶催化具有许多独特的优势，如反应物扩散速率快(尤其当底物为气体时)、无须添加溶剂、催化剂易于回收和再利用等。但是，无水的环境同样影响着酶分子的活性与稳定性，严重限制了气相酶催化的发展速度。因此，如何在无水的环境下营造出水相，为酶分子提供湿润的微环境成为解决问题的关键。Xu等[12]借助富含羟基的氧化石墨烯(GO)气凝胶作为固定化酶载体，通过提供类似水的微环境，在无水气体流动过程中保持酶的活性和稳定性：首先将脂肪酶和氧化石墨烯溶液在pH 3.3下混合，摇匀形成脂肪酶氧化石墨烯水凝胶；然后将水凝胶在-40 ℃冷冻干燥50 h，得到脂肪酶氧化石墨烯气凝胶(图1(b))；结果发现，与冻干的脂肪酶相比，被GO固定的脂肪酶的表观活性提升5～10倍，并且在酯交换反应中的初始酶活能够维持500 h。同时，固态圆二色性测定证实了亲水、柔性和多孔的载体在高温下可稳定脂肪酶的天然构象；分子动力学模拟计算结果和热重分析表明，脂肪酶活性所必需的水分子可以被氧化石墨烯表面的羟基所取代[13]。

2 酶-无机纳米晶体复合物

无机晶体具备良好的刚性结构，能够很好地稳定酶分子不受外界环境破坏，是固定化酶载体非常重要的一类分支。Ge等[14]基于共沉淀机制，将含有酶分子的磷酸盐缓冲溶液与CuSO4溶液混合，利用酶分子的诱导成核作用，成功将酶分子包埋在无机晶体中，首次合成出花状结构的含酶无机纳米晶体复合物，结果发现，制备的漆酶-磷酸铜复合物活性是游离漆酶的5～7倍，且在水溶液中放置60 d，活性仍能维持在95%以上。该工作得到了研究者们的广泛关注，并延伸出一系列基于共沉淀法制备酶-无机晶体复合物的成果[15-21]。如，Li等[22]在制备酶-无机纳米晶体复合物的过程中引入高分子聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)，结果发现，这能够进一步提升酶分子的稳定性与催化活性。在此基础上，Li等[23]在共沉淀过程中加入双酶，通过反应流程控制实现了双酶分隔式固定化(葡萄糖脱氢酶分布在酶-无机纳米晶体复合物的外部，辣根过氧化物酶分布在酶-无机纳米晶体复合物的内部)，结果发现，双酶-无机纳米晶体复合物不仅增强了2种酶分子的稳定性，还提升了双酶级联催化活性。酶-无机纳米晶体复合物除了能够提升酶分子的稳定性与活性之外，晶体中的金属离子还能赋予复合物全新的催化性能。Li等[24]以水胆矾[Cu4(OH)6SO4]作为无机组分制备酶-无机纳米晶体复合物，结果发现，该复合物具有抗菌活性，它的抗菌性能与CuO的效果接近，暴露300 min后仅有约104个细胞存活，表现出较为出色的抗菌效果。

金属-有机骨架(metal-organic frameworks,MOFs)材料是由金属离子或团簇和有机配体通过配位键结合而成的有机/无机杂化且具有周期性的多孔道复合结构，因其丰富的孔结构、高比表面积和易功能化修饰等优点，被广泛应用于气体捕集、多相催化、药物递送和酶固定化等领域[25-34]。MOFs材料固定化酶的方法分为3类：①酶吸附在预先合成的MOFs材料孔道中[35-39]；②酶共价结合在预先合成的MOFs材料表面或孔道中[40-41]；③共沉淀原位合成酶-MOFs材料复合物[42-46]。其中，共沉淀固定化方式无须预先合成MOFs材料，简化了制备流程。在通常情况下，采取共沉淀方式固定化酶的负载量要高于其他2种方式，且在使用的过程中酶分子不易脱落。

Lyu等[47]将高分子修饰的细胞色素c与合成MOFs材料的有机配体预先混合，随后添加到含有金属离子的甲醇溶液中，通过共沉淀法实现酶分子在MOFs材料自组装过程中的原位包埋(图2(a))，结果发现，与游离的细胞色素C相比，制得的酶-MOFs材料复合物的活性提升了10倍，并且可方便、快速且高灵敏度地检测溶液中痕量爆炸性有机过氧化物。Wu等[48]为了进一步提升酶-MOFs材料复合物的稳定性与重复使用性，利用聚多巴胺对酶-MOFs材料复合物进行包裹，结果发现，聚多巴胺包裹的酶-MOFs材料复合物具备超高的重复使用性能，重复使用10次后，酶活无明显降低的趋势。Wu等[49]通过在共沉淀过程中添加双酶，开发了在25 ℃水溶液中一步合成多酶-MOFs材料复合物的策略，结果发现：MOFs材料支架的刚性结构极大地提高了双酶的热稳定性，同时屏蔽了蛋白酶的水解作用；激光共聚焦显微镜结果证实，葡萄糖氧化酶(GOx)倾向于分布在颗粒外部，而HRP则分布在颗粒内部，这种分区包埋带来的双酶邻近和区域化效应提高了双酶级联反应中间产物的局部浓度和利用效率，从而实现了对葡萄糖的快速、高灵敏检测。

图2 一步共沉淀酶-MOFs材料复合物与酶-无定形MOFs材料复合物的构建与反应过程强化Fig.2 Construction and reaction process enhancement of enzyme-MOFs complexe and enzyme-amorphous MOFs complexes with one step co-precipitation

Feng等[35]制备了一系列不同尺寸的有机配体，利用Zr与有机配体结合，成功制备了具有不同孔径的MOFs材料，将其中的PCN-333固定多种蛋白后发现、表观米氏常数降低，表明对底物亲和性增强；同时，在经有机溶剂处理后和多次使用后，固定化酶的活性均明显优于游离酶。在此基础上，Lian等[38]结合有机配体设计方案开发了新的MOFs材料，使MOFs材料上同时具备3种不同尺寸的孔径(其中大孔能容纳1个GOx；中孔仅能容纳1个HRP，无法容纳GOx；小孔无法容纳蛋白)，经研究发现，尺寸较小的辣根过氧化物酶可以进入2种尺寸的孔径，而尺寸较大的GOx只能进入大孔径的孔道。Lian等[51]利用MOFs材料将酶递送进胞内，构建胞内酶催化体系，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。Shieh等[46]和Liao等[52]在水相和常温的条件下，通过一锅法将过氧化氢酶共沉淀负载于ZIF-90中，结果发现，经过尿素处理后，固定化酶仍保留很高的酶活，这是因为制得的固定化酶能够有效对抗酶变性剂对蛋白质的去折叠作用，对内部的酶分子具有明显的保护作用。Yang等[53]尝试利用一锅法自组装将Cas9 RNP负载于ZIF-90中，成功实现了HeLa细胞中的基因编辑。Liang等[54]发现，在使用不同亲疏水性的MOFs材料对酶进行固定时，对固定化酶的活性和稳定性有显著的差异性：当使用亲水性MAF-7时，其包埋酶的活性与游离酶的活性接近；亲水性的MAF-7或ZIF-90包裹的酶即使暴露在高温、变性剂、蛋白水解剂以及有机溶剂中也能保持活性，而疏水性的ZIF-8对脲酶的保护作用甚微。

因为晶态MOFs材料内部孔道较小，所以底物分子在酶催化过程中存在传质阻力，难以实现与晶体中的酶分子高效接触，从而降低了酶催化剂的表观活性。对MOFs材料进行改性，构建一定程度的缺陷能够达到丰富MOFs材料孔道结构的效果。合成后预处理法和从头合成法是2种构建MOFs材料缺陷的有效策略。合成后处理法是指使用改性配体、蚀刻剂或其他苛刻的活化程序(如热活化、等离子体活化等)对预先合成的MOFs材料进行处理，从而实现缺陷MOFs材料的合成[55-59]。从头合成法是指设计及优化MOFs材料的合成条件在合成的过程中引入缺陷结构。溶剂的种类、调节剂的类型、调节剂的加入量和晶体的生长速率等参数都会直接影响MOFs材料的改性和缺陷的产生。

目前，最常用的方法是在有机配体中添加调节剂[60-64]。Liu等[64]利用锆基金属有机骨架材料HP-PCN-224(Fe)来构建一个模拟多酶系统，通过引入十二烷酸作为调节剂诱导缺陷形成得到HP-PCN-224(Fe)的多级孔结构，结果发现：十二烷酸的加入量对于介孔的形成和MOFs材料的形貌影响很大，当十二烷酸与ZrCl4的摩尔比值为125时，HP-PCN-224(Fe)的酶负载量可达到192.6 mg/g；HP-PCN-224(Fe)中的金属卟啉结构使其具备本征过氧化物酶活性，可以与GOx级联用于葡萄糖检测，当葡萄糖浓度为5～300 μmol/L时，生物传感器具有良好的线性响应，检测限为0.87 μmol/L；将尿酸酶固定在HP-PCN-224(Fe)上，检测限可达1.8 μmol/L。

Wu等[50]通过调控MOFs材料在水相中生长的溶液条件，制备酶-无定形MOFs材料复合物(图2(b))，结果发现：无定形MOFs材料不但保留了晶态MOFs材料基本的结构单元和特性，而且其配位存在缺陷，具备大量的介孔，有助于提高传质效率；酶-无定形MOFs材料复合物除了具有与游离酶相当的表观活性之外，其良好的分散性与胞吞性能，在胞内葡萄糖检测中展现出了比天然葡萄糖氧化酶更优越的灵敏性。Zhang等[65]在共沉淀合成无定形MOFs材料的过程中添加双酶，建立双酶-无定形MOFs材料复合物用于胞内乳酸检测，结果发现：以双酶-无定形MOFs材料复合物作为人工构建的细胞器，能够将双酶递送到细胞内，对细胞内的乳酸表现出较高的催化活性和选择性，信噪比(S/N)提升了650倍。

配体混合法是另一种构建缺陷MOFs材料的有效策略[66-67]。在从头合成的过程中，用基团不同的配体部分来替代原骨架结构中的有机配体，利用混合具有目标功能的配体达到增加MOFs材料活性位点或缺陷数量的目的。Feng等[68]基于缺陷工程方法，在合成ZIF-8的过程中添加另一种有机配体1-甲基咪唑，使得原本ZIF-8的完美晶体结构被打乱，从而导致金属有机骨架进行重排，并产生了介孔结构，并将葡萄糖氧化酶和胰岛素共同封装在缺陷MOFs材料中，构建一种药物输送系统，结果发现：缺陷的MOFs材料不仅可以使胰岛素药物在高浓度葡萄糖溶液(12 mmol/L)中迅速释放，还可以减缓其在低浓度葡萄糖溶液(5 mmol/L)中的释放速率，从而有望构建出针对高血糖和正常血糖做出不同响应的胰岛素给药体系，为糖尿病自主治疗提供新的给药思路。Hu等[69]借助微流体通道内层流梯度混合产生的晶体缺陷效应来，制备酶-无定形MOFs材料复合物，因为在微通道中，层流状态下反应物分子自由扩散形成的浓度梯度使得每个酶-MOFs材料复合物颗粒在形成过程中经历了显著的浓度扰动，导致出现大量的配位缺陷，进而形成介孔结构，结合实验结果与理论计算发现，在微流控层流合成的酶-无定形MOFs材料复合物中存在大量孔径为3～6 nm的介孔，这些介孔在后续的酶促反应中有利于底物分子的传质；此外，在催化活性方面，微流控层流合成的酶-无定形MOFs材料复合物的表观活性比溶液法合成的晶态MOFs材料的提高了5～20倍，展现出了较高的酶催化能力。

尽管研究者们针对不同应用场景和不同酶开发了性能各异的酶-无机纳米晶体复合物用于强化不同酶催化反应过程，但是仍然缺乏普适性的方法以满足大部分酶的需求。因此，开发通用性更强的平台技术是未来研究的目标。

3 酶-金属复合催化剂

酶催化反应类型受限是天然酶在实际工业应用中的另一大挑战。利用酶-金属复合催化可开发出现有酶催化或金属催化无法实现的新型级联反应，是拓展催化反应类型的有效策略之一。然而，当酶催化与金属催化以分步方式进行时，在每步反应之间往往需要对中间产物进行分离提纯的操作，该过程通常会造成产物的损耗，同时还需要投入大量的成本。因此，将酶催化与化学催化相融合，构建一锅酶-金属级联催化反应，不仅能够提升原子经济性、节省时间与降低中间产物的分离成本，还能推动级联反应向产物的方向进行。然而，酶催化与金属催化的最适反应条件相差较大，为了避免酶催化剂在恶劣环境中丧失活性与选择性，在温和条件下使酶催化剂与化学催化剂发挥各自较高的催化性能是解决问题的关键所在[70-71]。

酶-金属级联催化的一个典型例子为动态动力学拆分(dynamic kinetic resolution,DKR)反应。在DKR中，酶选择性催化酰基化反应，金属催化外消旋反应，将剩余的某一构型的底物再变为外消旋混合物。Engström等[72]将Pd纳米颗粒与酶共固定至硅基中孔泡沫材料的空腔中得到了酶-金属的复合催化剂，结果发现：以甲氧基乙酸乙酯为酰基化供体，在1 个标准大气压(atm)的H2和70 ℃条件下，在16 h内催化得到(R)-1-苯乙胺的酰基化产物，收率99%，对映体过量值(e.e.值)为99%；在金属催化的酮还原酶辅因子再生级联反应中，Rh催化剂以甲酸盐作为底物催化NAD+转化为NADH，马肝醇脱氢酶催化酮还原为(S)-型手性醇。该体系存在的问题为酶与金属配合物不相容，它们之间的非特异性相互作用会导致酶和金属活性均降低或失去活性。Himiyama等[73]将Rh催化剂固定化在介孔SiO2中，实现了酶与金属催化剂的空间分隔，由于孔径大小的限制，酶分子与Rh催化剂在溶液中无法接触，因此避免了二者的失活，实现手性醇的高效合成。Wang等[74]通过原位合成法将NiPd中空纳米颗粒和GOx共固定在ZIF-8上，合成的GOx@ZIF-8(NiPd)酶-金属复合催化剂具有纳米花状结构，同时具有葡萄糖氧化酶和类过氧化物酶活性，以此构建葡萄糖电化学传感器或葡萄糖比色传感器，结果发现：在505 nm处的吸光度值与葡萄糖浓度呈良好的线性关系，检测限可达9.2 μmol/L；电化学检测中，当检测浓度为0.1～1.7 mmol/L时，电流强度与葡萄糖浓度呈良好的线性相关性，且连续使用16次后，相对标准偏差(RSD)仅为0.8%，表明该生物传感器具有良好的操作稳定性和准确性。

由于反应分子在2种催化剂之间经历多次吸附脱附过程，所以存在耦合催化反应效率降低的问题，因此，构建酶-金属复合催化剂能够尽可能缩短酶活性位点与金属活性位点之间的距离，减少反应分子在2种活性位点之间的脱附—扩散—再吸附过程，从而提升整体级联催化效率[75]。Li等[76]以核壳结构酶-高分子络合物为模板，以原位还原法将金属亚纳米团簇固定在酶-高分子配合物内部，制备酶-金属亚纳米团簇复合催化剂(图3(a))，结果发现：当Pd颗粒大小从纳米尺寸逐渐下降至亚纳米尺寸时，Pd亚纳米团簇在酶促反应最适温度条件下的催化活性得到了显著提升，为商业催化剂Pd/C的52倍；密度泛函理论(DFT)计算结果显示，当Pd颗粒尺寸从2.5 nm减小至0.8 nm时，表面Pd原子的Pd—O成键数从1.7提高到2.5，可见通过降低底物吸附能，可提高亚纳米团簇的催化活性。这些结果证实，金属亚纳米团簇的活性位点暴露与酶分子表面氨基酸残基的氧原子相互作用是增强Pd催化剂尺寸效应的主要原因。此外，在各种手性胺中间体的动力学拆分反应中，酶-金属亚纳米团簇复合催化剂具有比Novozym 435与Pd/C商业催化剂更高的级联催化效率。

图3 酶-金属亚纳米团簇复合催化剂与酶-金属单原子复合催化剂的构建与过程强化Fig.3 Construction and reaction process enhancement of enzyme-metal subnanocluster hybrid catalyst and enzyme-metal monoatomic hybrid catalyst

将金属催化剂的尺寸控制在单原子级别，有望进一步实现酶催化与金属单原子催化在温和条件下的协同效应。然而，酶分子表面氨基酸残基往往难以稳定地结合金属单原子。为了解决这一问题，Li等[77]以酶-高分子配合物为模板，借助光化学法在高分子链上产生碳自由基，然后利用碳自由基分别和酶分子上的氨基酸残基与金属原子共同作用，成功制备了稳定结合的酶-金属单原子复合催化剂(图3(b))，实验结果与理论计算证实了酶活性口袋与反应物的烷基链结合，可稳定Pd单原子催化烷基-烷基交叉偶联反应的过渡态，从而降低反应活化能，实现了烷基-烷基偶联反应在温和条件下的高效协同催化；同时发现，在催化碳碳偶联反应的转化频率(TOF)方面，制备的酶-Pd单原子复合催化剂分别是均相催化剂Pd(PPh3)4和商业化多相催化剂Pd/C的1.6和2.3倍。此外，该研究还利用酶活性口袋对烷基链的选择性，开发了基于酶-Pd单原子复合催化剂的生物-化学一锅级联反应合成联苯类手性醇的新路线。

为了进一步发掘更有潜力的酶-金属级联/协同催化反应，需要对酶-金属复合催化剂进行理性设计；同时，针对不同的金属和酶，需要开发通用的复合催化剂设计平台。

4 结论与展望

工业酶稳定性差和催化反应类型的局限一直是困扰酶催化进一步工业应用的瓶颈。开发高稳定性、高活性和高传质效率的固定化酶和构建具有拓展酶催化反应类型的酶-金属复合催化剂为解决天然酶的不足提供了新的策略。

本文综述了近年来在开发新型固定化酶与酶-金属复合催化剂方面的研究进展，重点介绍了酶纳米凝胶、酶-无机纳米晶体复合物、酶-有机/无机杂化复合物，酶-金属复合催化剂领域的研究成果。基于共沉淀法构建的酶纳米凝胶、酶-无机纳米晶体复合物、酶-有机/无机杂化复合物能够在保留表观活性的同时，增强酶分子的稳定性与重复使用性；开发酶-无定形MOFs能够进一步降低传质阻力，增强酶分子的表观活性；构建酶-金属复合催化剂不仅能够催化新的反应，还能缩短酶活性位点与金属活性位点之间的距离，使得中间产物的脱附-扩散-再吸附过程显著减少，在2种活性位点间形成类似的“底物通道”，可实现两步催化反应的耦合，提高催化反应效率。

未来，在面向实际应用的场景，需要开发兼具稳定性和经济性的固定化酶技术与载体材料，并应用于实际工业生产中。在酶-金属复合催化剂方面，需要将更多不同种类的金属(Ru、Rh、Co和Ni等)和酶(漆酶、醇脱氢酶、胺脱氢酶和烯醇还原酶等)进行耦合，开发新型酶-金属级联/协同催化反应和稳定高效的酶-金属复合催化剂。