三叶青Th MYB 1及Th MYB 2转录因子的克隆及生物信息学分析

赵刚,罗怿文,闻静*

(1.上饶师范学院生命科学学院,江西 上饶 334000;2.永新中学,江西 吉安 343499)

三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)为多年生蔓生藤本植物,学名三叶崖爬藤,属于葡萄科崖爬藤属,喜阴凉,多生长在林下,具地下块根[1]。三叶青是我国具有悠久民间药用历史的植物,现代药理学研究表明三叶青块根提取物具有消炎、镇痛及解毒等作用[2],对一些慢性疾病如糖尿病及高脂血症等也具有良好的治疗效果[3－4],其块根提取物中的黄酮类化合物对肿瘤的治疗有卓越的效果,有巨大的抗肿瘤临床应用价值[5]。MYB(V－myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子家族以含有独特的MYB结构域为分子结构特征[6],迄今为止的研究显示MYB转录因子在植物中普遍存在,并在植物对干旱与高盐等非生物胁迫的耐逆性应答[7－8]及次生代谢物质的合成代谢过程中扮演重要角色[9－11],特别是在黄酮类化合物合成代谢中起到重要作用[12－13]。

本课题组的前期研究发现,在三叶青块根发育过程中伴随着黄酮类化合物的显著积累,MYB类转录因子大量差异表达。从三叶青块根的转录组数据库中筛选表达丰度最高的两个MYB 转录因子ThMYB1和ThMYB2,克隆该基因的cDNA 序列,对之进行测序及初步的生物信息学分析,以期为进一步研究该基因与三叶青块根发育及与黄酮类化合物合成代谢的相关性提供分子生物学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以玉山县农林合作社自主驯化栽培的怀玉山三叶青品种“怀玉2号”为实验材料,该三叶青栽培种为国家地理标志农产品。

针对多酚多糖中药植物的专用RNA 提取试剂盒,由北京华越洋生物科技有限公司提供;反转录(RTPCR)试剂盒、胶回收试剂盒、克隆测序所用的载体及感受态细胞(E.coli DH5α),大连宝生物科技有限公司提供;PCR 高保真酶(Trans Taq DNA ploy High Fidely),北京全式金生物科技有限公司提供;从国药集团采购Boiwest琼脂糖、Tris－base、氯仿、EDTA 等试剂;PCR 引物合成由上海生物工程股份有限公司合成;cDNA 样品送南昌华大生物科技有限分公司测序。

1.2 三叶青总RNA 的提取及cDNA 的合成

以三叶青的芽为样本提取总RNA,称取100mg幼芽进行液氮研磨,具体提取方法参照试剂盒说明书。RNA 提取后采用Spec Nano检测RNA 的纯度及浓度,采用RNA 浓度大于200 ng/μL的总RNA 用于反转录(RT－PCR),反转录的体系及温控条件参考说明书进行设置。

1.3 Th MYB 转录因子基因的克隆和测序

从三叶青转录组筛选并调取ThMYB基因的cDNA 序列,利用Primer 3－SGD 在线程序设计扩增两个MYB转录因子的引物,用于扩增基因cDNA 全长,引物信息见表1。PCR 体系的配置方法参照说明书,热反应条件如下:98℃变性1 min;98℃变性15s,55℃退火10s,72℃延伸1.5 min,反应40个循环;72℃延伸5 min。以0.8%琼脂糖TAE 凝胶电泳检测PCR产物的有无及其位置。PCR产物纯化后与克隆载体p MD－18T载体连接并转化大肠杆菌,氨苄霉素(50mg/m L)筛选阳性菌落,菌落PCR检测后挑选两个以上阳性克隆扩大培养后,提取质粒后送公司测序。

表1 用于Th MYB 基因克隆的引物序列

1.4 生物信息学分析

利用NCBI网站中开放读码框预测(ORF－Finder)模块推测开放读码框位置并获得氨基酸序列,利用蛋白质比对模块(Blastp)分析蛋白质的氨基酸序列与已知序列的相似性;利用信号肽在线预测模块(SignalP－5.0)预测Th MYB1和Th MYB2蛋白质信号肽的有无;利用SOPMA在线程序分析蛋白质的保守氨基酸序列及二级结构特征;利用ExPASy分析蛋白质理化性质及亲/疏水性;利用Cell－PLoc 2.0预测蛋白质亚细胞定位;利用SWISS－MODEL在线模块构建蛋白质的三级结构空间模型;使用MEGA7.0软件构建系统发育进化树。

2 结果

2.1 Th MYB 1和Th MYB 2基因的克隆

通过PCR 扩增成功克隆怀玉山三叶青的ThMYB1和ThMYB2基因,获得包含完整读码框的cDNA序列,通过测序获得的ThMYB1基因片段全长1 450bp,ThMYB2基因片段全长856bp,具体如图1所示。

图1 Th MYB 1与Th MYB 2 PCR 产物的电泳检测结果

2.2 三叶青Th MYB 基因的生物信息学分析

2.2.1ThMYB1与ThMYB2基因推测蛋白质一级结构及二级结构分析

ORF Finder在线分析表明,ThMYB1基因的ORF长度为960bp,编码319个氨基酸(图2)。Blastp比对结果显示与葡萄(Vitisvinifera)的MYB家族转录因子PHL6(登录号RVW63118.1)相似度最高,覆盖度为98%,相似度为80.50%;蛋白质保守域分析表明,Th MYB1在97－153氨基酸位点间存在MYB 特征SHAQKYF的DNA 结合域,在189－235氨基酸位点具有Myb_CC 特征的LHEQLE 保守域。ThMYB2的ORF长度为489bp,编码162个氨基酸(图3),blastp 比对结果显示与河葡萄(Vitisriparia)的MYB家族转录因子(登录号XP_034693329.1)相似度最高,覆盖度为94%,相似度为95.93%;推测蛋白质序列在78－105氨基酸位点存在PLN03212(Transcription repressor MYB5;Provisional)保守域。以上生物信息学初步分析表明,ThMYB1与ThMYB2基因的推测蛋白质为植物MYB家族成员。ThMYB1与ThMYB2基因推测氨基酸序列的相对分子质量、等电点、信号肽预测及亚细胞定位如表2所示。

图2 Th MYB 1测序所得序列及ORF finder翻译结果

图3 Th MYB 2测序所得序列及ORF finder翻译结果

表2 Th MYB 1与Th MYB 2基因编码推测氨基酸序列的相对分子质量、等电点、信号肽、细胞亚定位和亲/疏水性

2.2.2ThMYB1和ThMYB2推测蛋白质的三级结构

ThMYB1推测蛋白质的3D 模型是以磷酸盐亏欠响应蛋白质2(Protein PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 2)的模型建立起来的,模型对序列有效的识别率达到了62.12%;ThMYB2推测蛋白质的3D 模型是以SAGA 辅助因子(SAGA－associated factor 11)为基本模型建立起来的,但是序列有效识别率较低为18.8%(图4)。

图4 Th MYB 1与Th MYB 2推测蛋白质的3D 模型

2.2.3ThMYB1和ThMYB2进化树的构建

利用Blastp对两种蛋白质进行同源性比较,分别选取与Th MYB1和Th MYB2蛋白质同源性较高的其他植物的MYB蛋白质序列,使用MEGAX 软件中的Neighbor－Joining法构建Th MYB1和Th MYB2蛋白质系统发育进化树,结果如图5所示。Th MYB1蛋白质与葡萄MYB 类转录因子PHL6处于同一进化分支,Th MYB2蛋白质与河葡萄的MYB5转录因子处于同一进化分支,Th MYB1与Th MYB2两种蛋白质序列相似性较低,处于不同的进化分支。

图5 Th MYB1与Th MYB2系统进化树的构建

3 讨论

MYB蛋白质超家族数量庞大,功能多样,存在于所有真核生物中,大多数MYB蛋白质作为转录因子发挥作用,多重复结构域的主要功能是结合DNA 模板[14]。MYB 蛋白质的结构特征在于高度保守的MYBDNA 结合域,通常该结构域由最多四个重复序列(被称为R 序列)组成,每个重复序列约包含52个氨基酸或更少数量的氨基酸,每个重复序列形成三个α－螺旋,其中第二个和第三个螺旋能够形成一个螺旋－转角－螺旋(HTH)结构,具有三个规则间隔的色氨酸(或疏水)残基,在3D HTH 结构中形成疏水核心[15]。MYB类蛋白质可以根据临近重复序列的数量多少分成4个不同亚家族,其中最小的一类是4R－MYB亚家族,其成员包含四个类似R1/R2的重复序列,目前对该类蛋白质研究极少[16];第二类是指R1R2R3型MYB(3R－MYB)蛋白质,编码3R－MYB蛋白质的基因已在大多数真核生物基因组中被发现,主要在细胞周期控制中发挥着不同的作用[17];第三种MYB相关亚家族蛋白质仅含有单个或部分MYB重复的蛋白质,统称为MYB相关家族(1R－ MYB/MYB－related)[18－19],本研究中的ThMYB2基因只有一个PLN03212保守域,因此Th MYB2属于该1R－MYB/MYB－related亚家族;第四种R2R3－MYB 转录因子,在N 端带有DNA 结合结构域(即MYB结构域),而在C 端则带有激活或抑制结构域,Th MYB2在N 端(97－153氨基酸位点)存在MYB特征SHAQKYF的DNA 结合域,在C端(189－235氨基酸位点)具有Myb_CC特征的LHEQLE保守域,因此Th MYB1属于该亚家族[20]。由于保守域的不同,Th MYB1及Th MYB2分属不同的MYB亚家族,Th MYB2所属的R2R3－MYB亚家族的蛋白质参与到较为广泛的植物学生物过程中,包括次生物质的代谢[21]、生物胁迫[22]与非生物胁迫[23]、细胞分化与纤维发育[24]及种子萌发[25]等生物学过程;而关于Th MYB1所属的MYB/MYB－related的亚家族的研究较少,目前只发现该类亚家族蛋白质有可能参与到低温胁迫[26]及ABA 的信号转导[27]。

目前有大量的研究表明,植物地下储藏器官中黄酮类化合物的代谢与MYB转录因子密切相关。St-MYB12A的过表达显著增加了马铃薯(Solanumtuberosum)块茎中黄酮醇和其他苯丙素的含量[28]。Yu等[29]的研究表明,芒柄花素和刺槐素含量在美丽鸡血藤(Calleryaspeciosa,Champ.ex Benth)块根发育过程中显著增加,R2R3－Cs MYB可能调控了参与异黄酮生物合成途径的结构基因的表达。MYB－b HLHWD40/MYB－b HLH－WD40－WRKY 复合物可结合花青素结构基因IbDFR的启动子并激活该基因的表达,以维持甘薯(Ipomoeabatatas)块根中花青素的积累[30]。Th MYB2蛋白质与河葡萄的MYB5转录因子亲缘关系最近,阿马托(Amato)等[31]的研究表明,葡萄的MYB5转录因子能够使MBW 复合物与WRKY因子结合,以增强参与葡萄中液泡超酸化和运输相关的靶基因的表达。ThMYB1转录因子与葡萄MYB类转录因子PHL6处于同一进化分支,而关于葡萄VvPHL6基因的功能,目前还没有报道。

植物的MYB类转录因子广泛参与到植物的生长发育过程中,目前MYB类转录因子对于三叶青黄酮类化合物生物合成调控的研究还未见报道,前期转录组数据研究表明,蓝光辐照后伴随着黄酮类化合物含量提高,ThMYB1和ThMYB2转录因子的表达量显著提高,但是ThMYB1和ThMYB2转录因子在三叶青块根发育过程中的表达与黄酮化合物的积累是否相关,还需要进一步通过转基因功能验证进行研究。