顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱解析泉香型白酒的风味物质

秦炳伟,吕志远,张梦梦,刘阳晴雪,刘玉涛,王文洁,胥鑫钰,李小杰,崔新莹,商海林,王瑞明,高红波*,宋妍妍

1(齐鲁工业大学 生物工程学院,山东 济南,250353)2(济南趵突泉酿酒有限责任公司,山东 济南,250115)3(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)4(广州禾信仪器股份有限公司,广东 广州,510535)

中国白酒根据原料、发酵容器、生产工艺、糖化发酵剂和贮存方式不同,分为十二大国标香型和其他香型,每种香型具有不同的风格特点。趵突泉是济南七十二大名泉之首,被誉为“天下第一泉”,趵突泉白酒采用趵突泉源头之水酿酒,将传统芝麻香型工艺与浓香型工艺相结合,采用砖泥混合窖,隔轮堆积的方式,独创了泉香型白酒。泉香型白酒既有芝麻香型白酒的优雅细腻,又有浓香型白酒醇甜甘冽的风格特点,已成为消费者喜爱的白酒。为更好地剖析泉香型白酒的特点,本实验利用顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱(headspace solid phase microextraction -comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, HS-SPME-GC×GC-TOF-MS)对泉香型白酒的挥发性组分进行检测,定性、半定量分析。

目前,白酒中挥发性组分的研究一般采用常规色谱法,属于一维气相,存在化合物共流出的问题。全二维色谱技术(GC×GC)是最近20年新开发出的一种全新的色谱分离技术,采用连续调制的方式将第一维色谱柱中分离的组分全部转移至第二维色谱柱中进行进一步分离,具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量、族分离等优势,是当前能够实现的最高分辨率的色谱分离技术[1],可以解决一维气相共流出问题[2]。对于白酒香气的研究,国内使用全二维技术,主要通过不同前处理方式[2-7]检测易挥发性组分,利用匹配度、相似性进行定性,但是对利用正构烷烃保留指数(retention index, RI)进一步定性后易挥发组分与香气贡献度结合进行分析的研究较少,如ZHU等[6]优化了色谱柱组合并认为极性+中极性组合更有利于白酒中挥发性物质的分离,然后采用液液萃取结合GC×GC-TOF-MS,根据软件解析、有序色谱和该团队开发的RI库在茅台酒中发现了528种组分,但仅列出部分成分;YAO等[7]采用液液萃取与顶空固相微萃取(HS-SPME)结合GC×GC-TOF-MS,根据软件解析在泸州老窖酒中鉴定出超过1 300种物质,并认为不同处理方法对鉴定结果有显著影响。季克良等[8]利用GC×GC-TOF-MS技术根据质谱鉴定出酱香型白酒中匹配度大于800的组分共873种物质,在浓香型白酒中有342种物质,在清香型白酒中有178种物质;陈双等[9]采用HS-SPME结合GC×GC-TOF-MS 解析了芝麻香白酒中的挥发性组分,根据相似度、可能性与二维色谱出峰规律比对验证,在芝麻香白酒中鉴定出340种挥发性成分。

基于全二维色谱技术的优势,本实验采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS,利用NIST库匹配度可能性、正构烷烃RI值定性和内标法半定量,首次对泉香型白酒风味物质进行全面的解析,为泉香型白酒挥发性组分的定性与部分关键风味物质的研究奠定了基础,并探究了泉香型与浓香型和芝麻香型白酒的差异性与共性,使消费者更好地了解泉香型白酒风格特点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同批次泉香518(51.8%vol),济南趵突泉酿酒有限责任公司。

无水乙醇(色谱纯)、乙酸正戊酯(纯度均为99.9%)、2-乙基丁酸(纯度均为99.9%)、叔戊醇(纯度均为99.9%)、2-甲氧基-3甲基吡嗪(纯度均为99.9%)、异丙基二硫醚(纯度均为99.9%)、2 mg/L C7～C40正构烷烃混合标准品(纯度99.9%)、正戊烷(色谱纯),百灵威科技有限公司;分析级氯化钠,西陇科学公司。

1.2 仪器和设备

GT0620全二维气相色谱-飞行时间质谱,广州禾信仪器股份有限公司;一维色谱柱FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、调制柱(1.3 m×0.25 mm)、二维色谱柱DB17(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),美国安捷伦科技公司;SPME arrow(1.1 mm×20 mm×120 μm)(Divinylbenzene/carbon wide range/polydimethylsiloxane)、顶空固相微萃取多功能自动进样系统,广州智达实验室科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制

乙醇溶液(50%,体积分数):量取250 mL无水乙醇于500 mL容量瓶中,用纯净水定容,混匀。

乙酸正戊酯(20 000 mg/L)、2-乙基丁酸(20 000 mg/L)、叔戊醇(20 000 mg/L)、2-甲氧基-3-甲基吡嗪(100 mg/L)、异丙基二硫醚混合内标溶液(100 mg/L)混合内标溶液:分别准确称取2.000 0 g乙酸正戊酯[10]、2.000 0 g 2-乙基丁酸[10]、2.000 0 g叔戊醇[10]、0.01 g 2-甲氧基-3-甲基吡嗪、0.01 g异丙基二硫醚,加入适量的乙醇溶液(50%,体积分数)溶解,转移至100 mL容量瓶中,定容,充分混匀。

500 μg/L C7～C40正构烷烃混合标准液:吸取25 mL 2 mg/L C7～C40正构烷烃混合标准品,用适量的正戊烷溶解,转移至100 mL容量瓶中,定容,充分混匀。

1.3.2 样品前处理

用超纯水将酒样稀释到乙醇体积分数为12%,吸取5 mL稀释后的酒样放入20 mL顶空瓶中,加入1.5 g NaCl,再加入50 μL混合内标溶液,压紧瓶盖,HS-SPME-GC×GC-TOF-MS仪器检测。

吸取1 mL 500 g/L正构烷烃混合标准液放入进样瓶中,采用直接进样法GC×GC-TOF-MS仪器检测(与样品检测进样方式不同外,仪器条件相同)。

1.3.3 仪器条件

GC×GC条件:一维柱ZB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),二维柱DB-17 HT(0.6 m×0.25 mm×0.25 μm),进样口温度230 ℃,分流比10：1;载气为高纯氦气(纯度>99.999 5%),流速为1.0 mL/min;色谱柱升温程序:初始温度40 ℃,5 min后以3 ℃/min升温至200 ℃,保持5 min,后运行230 ℃,后运行时间5 min。

飞行质谱条件:溶剂延迟3.5 min,采用EI电离源,电离电压70 eV,离子源温度为230 ℃,接口温度230 ℃。检测器电压为-1 700 V,质谱扫描范围:45～500m/z,扫描频率为101 spectrum/s。

顶空固相微萃取自动进样:萃取温度50 ℃,样品平衡15 min,萃取45 min,萃取结束后,萃取头在250 ℃解吸附5 min。

1.3.4 计算公式

面积归一化计算如公式(1)所示:

(1)

挥发性物质半定量计算如公式(2)所示:

(2)

气味活度值(odor activity values, OAV)计算如公式(3)所示:

(3)

某化合物RI计算如公式(4)所示:

(4)

式中:tx,分析组分在气相色谱中的保留时间;tn和tn+1,碳原子数为n和n+1正构烷烃出峰的保留时间。

1.4 数据处理

二维数据由Canvas采集,Canvas scale工作站(版本1.0.0.19776)用于数据处理。

定性:GC×GC-TOFMS所检测化合物的定性通过质谱解析与NIST 18谱库检索、正向和反向匹配度>800;可能性≥75%;用C7～C40正构烷烃作为标准,RI比对,根据保留时间计算样品中检测化合物的RI或NIST库自动计算保留指数。

选取OAV≥1的成分作为对酒体香气关键风味物质。制表软件:WPS office;绘图软件:Origin2019。

2 结果与分析

2.1 泉香型白酒挥发性香气分析

2.1.1 泉香型白酒香气种类数的定性

通过顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱检测泉香型白酒,将正构烷烃的出峰顺序叠加在泉香型全二维图谱得图1。

图1 正构烷烃辅助定性的泉香型白酒HS-SPME-GC×GC-TOF-MS色谱图Fig.1 HS-SPME-GC×GC-TOF-MS atlas of spring aroma type Baijiu assisted by n-paraffin

由图1可知,共出峰1 258种,说明利用顶空固相微萃取全二维气质法能检测出泉香型白酒1 258种香气物质,选择正向匹配度与反向匹配度均大于800,可能性≥75%的香气成分,共566种,共分为15个类别,利用面积归一化分析每一类香气数量百分比和峰面积百分比(图2)。

图2 泉香型白酒香气类别峰面积和香气种类峰面积比例Fig.2 Peak area of aroma types and ratio of peak area of aroma types in Spring-flavor Baijiu

由图2可知,泉香型白酒酯类数量占化合物总数量的35%(198种),峰面积占总峰面积的56%;醇类化合物数量占化合物总数量的14%(80种),峰面积占总峰面积的11%。说明酯类和醇类为泉香型白酒的主要香气成分,此外根据各大类峰的数量和峰面积,发现醛类、酮类、酸类等化合物也同时作为酒中主要的可挥发物质的重要组成部分。与其他白酒风味物质的研究结论相一致,说明这几类物质是白酒中普遍存在的挥发性组分[9,11-12]。

2.1.2 泉香型白酒重要香气成分的定性

再根据正构烷烃RI值与香气物质NIST RI值差值在50以内,鉴定出白酒中重要香气化合物,见表1。

表1 泉香型白酒重要香气成分分类Table 1 Classification of important aroma components in Spring-flavor Baijiu

由图1、图2和表1可知,泉香型白酒挥发性组分1 258种,经匹配度与可能性定性后,可鉴定出泉香型白酒可信度较高的566种香气成分,再经正构烷烃RI值定性,鉴定出重要化合物251种。其中酯类峰面积占重要化合物总峰面积的85.65%[(51.11/59.67)×100%],说明酯类物质是泉香型白酒主要香气成分,与其他风味物质研究结论一致[13]。因此,对酯类成分进行分析。

2.1.3 泉香型白酒酯类成分的分析

对酯类成分进行分析见表2,然后通过内标法半定量方法计算出OAV值,选取OAV≥1贡献度较大的物质[14-16],作为酯类中关键香气物质见表2。

表2 酯类化合物的定性Table 2 Qualitative analysis of ester compounds

由表2和表3可得,泉香型白酒70种酯类物质中有21种化合物OAV≥1,说明这21种物质是酯类物质中关键风味物质。其中己酸乙酯OAV=27 233,说明己酸乙酯是泉香型白酒酯类中香气贡献度较大的化合物,而己酸乙酯为浓香型白酒的主体香成分,说明泉香型白酒具有浓香型白酒的特点;泉香型白酒中关键风味组分辛酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、庚酸乙酯等,是绵柔芝麻香型白酒关键挥发性物质[21],也是梅兰春和趵突泉芝麻香型白酒骨架成分[22],说明泉香型白酒也具有芝麻香型白酒的特点。因此从香气贡献度较大的酯类组分考虑,泉香型白酒兼有芝麻香和浓香的特点。

表3 酯类中对泉香型白酒贡献度较大的化合物Table 3 Compounds in esters that contribute more to Spring-flavor Baijiu

2.2 泉香型白酒与浓香型白酒和芝麻香型白酒共性与差异性分析

根据泉香型白酒的工艺和香气特点,本实验对泉香型白酒与本公司浓香型(52%vol)、芝麻香型(54%vol)白酒共性与差异性进行分析。结合本研究“2.1节”内容,酯类和醇类为泉香型白酒的主要香气成分,醛类、酮类、酸类等化合物也是其重要组成部分;另有研究表明,白酒中部分吡嗪类和含硫化合物是其重要香气成分[23-26],也是特殊功能的健康因子[27-30]。因此,本实验经过定性、内标法半定量,重点对泉香型白酒、浓香型白酒和芝麻香型白酒的酯类、醇类、醛类、酮类、酸类、吡嗪类及含硫化合物这七类可信度较高化合物进行分析。

2.2.1 泉香型白酒与浓香型和芝麻香型白酒重要化合物香气种类与峰面积分析

由图3和图4可知,3种香型中酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、吡嗪类、含硫化合物这七类可信度较高化合物总数量分别为:浓香型白酒372种、泉香型白酒394种、芝麻香型白酒427种;七类物质峰面积百分比分别为浓香84.224%、泉香86.544%、芝麻香92.508%。说明泉香型白酒与浓香型白酒和芝麻香型白酒差异性较大,而且泉香型白酒酯类化合物峰面积占比较浓香和芝麻香低,但是醇类、醛类、酮类化合物峰面积占比较高,说明泉香型白酒具有不同于浓香型和芝麻香型的风格特点。

图3 泉香型与浓香型和芝麻香型重要化合物数量的对比Fig.3 Comparison of the number of important compounds in Spring-flavor Baijiu, Luzhou flavor, and Sesame flavor

图4 泉香型白酒与浓香型和芝麻香型重要化合物峰面积的对比Fig.4 Comparison of peak areas of important compounds in Spring-flavor Baijiu, Luzhou flavor, and Sesame flavor

2.2.2 泉香型白酒与浓香型、芝麻香型白酒主要化合物分析

通过HS-SPME-GC×GC-TOF-MS实验定性和半定量后,选取相对较重要、而且3种香型中含量差异相对较大的11种酯类、8种酸类、11种醇类、3种醛类物质、3种酮类、8种吡嗪类、8种含硫化合物,进行热图对比分析。

由图5可知,3种香型中11种酯类化合物含量总和分别为泉香型4 073.6 mg/L、芝麻香型4 803.8 mg/L、浓香型3 056.3 mg/L,虽然泉香总酯含量和浓香型、芝麻香型差异性规律不一致,但是能说明泉香型白酒整体酯类丰富,香气馥郁,而且其己酸乙酯含量和丁酸乙酯含量与浓香型白酒较接近,说明泉香型白酒具有浓香型白酒的特点,而其他酯类组分与浓香型白酒有一定的差异性。3种香型中8种酸类化合物含量总和分别为泉香型2 375.6 mg/L、芝麻香型2 058.9 mg/L、浓香型2 035.2 mg/L。结合酸酯平衡,总酸加总酯的含量分别为泉香型6 449.2 mg/L、芝麻香型6 862.7 mg/L、浓香型白酒5 091.5 mg/L,泉香型总酸加总酯的含量介于芝麻香型和浓香型之间,说明泉香型白酒与芝麻香型白酒的差异性与共性。

A-酯类分析;B-醇类、醛类分析;C-酸类、酮类分析;D-吡嗪类和含硫化合物分析图5 热图比较泉香型与浓香型和芝麻香型白酒的差异性与共性Fig.5 Comparison of differences and commonalities in Spring-flavor Baijiu, Luzhou flavor, and Sesame flavor by heat map

醇类化合物对酒体风味的影响较酸酯类化合物小,但亦是酒体不可或缺的主体香气成分。泉香型白酒中,醇类主要化合物总含量低于芝麻香型,接近于浓香型。其中,异丁醇和3-甲基丁醇的含量低于浓香和芝麻香型,可相应减少酒体辛辣刺激感,提高感官舒适度,对泉香型白酒清雅细腻的感官特征具有一定的贡献。

醛、酮类化合物在白酒中起到呈香、协调平衡的作用。醛类化合物总含量排序为泉香型<浓香型<芝麻香型;酮类化合物总含量排序为泉香型>芝麻香型>浓香型,说明了泉香型与浓香型和芝麻香型白酒的差异性。

本实验共检测出:泉香型白酒中8种吡嗪类化合物,5种含硫化合物;浓香型白酒中8种吡嗪类化合物,4种含硫化合物;芝麻香型白酒中8种吡嗪类,8种含硫化合物。其中,2,6-二甲基吡嗪、吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醇、甲基糠基二硫醚含量排序为:芝麻香>泉香>浓香;2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、四甲基吡嗪含量排序为泉香型白酒中>芝麻香香型白酒>浓香型白酒;3-甲硫基丙醛含量排序为浓香型白酒>芝麻香型白酒>泉香型白酒,说明泉香型白酒具有与浓香和芝麻香型白酒不同的香气特点。

3 结论

采用顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱解析泉香型白酒的风味物质,共检测出1 258种香气成分,定性出可信度较高的成分566种,其中,重要化合物251种。在251种重要化合物中,酯类物质峰面积占85.65%,说明酯类物质是泉香型白酒主要香气成分。因此,利用内标半定量法对酯类成分进行OAV分析,鉴定出了21种贡献度较大的酯类关键风味物质。并且本实验通过对酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、吡嗪类和含硫化合物,与浓香型白酒和芝麻香型白酒进行了对比,以热图的形式,说明了泉香型白酒与浓香型和芝麻香型白酒的共性与差异性。本研究通过采用顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱检测、定性与面积归一化、内标半定量分析解析了泉香型白酒的挥发性物质的种类数与部分关键风味物质,后期还需要标准品的验证实验。