PPOI调控葡萄生长发育的机制研究

李镇江,杨志刚,唐晓芳,郑又铭,陶继文

(1.四川省食品发酵工业研究设计院有限公司,成都 611130;2.成都金开生物工程有限公司,成都 611130;3.天津科技大学生物工程学院,天津 300457;4.四川农业大学生命科学学院,四川 雅安 625014)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界上最重要的栽培水果之一,作为一种典型的非跃变水果,其生长受内源性和外源性因素调控[1]。赤霉素、乙烯、脱落酸、细胞分裂素等内源性激素在葡萄的整个生命周期中发挥重要作用[2]。此外,多种生长调节剂如IBA、CPPU和TDZ[3],化合物如蔗糖[4],以及一些酶和转录因子都参与了葡萄的生长发育[5]。

PPOI是由好氧微生物利用糖类发酵产生的次级代谢产物,由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性等性质,常用作防腐剂、保鲜剂、杀虫剂和抗菌剂等,被广泛应用在医药、农业、食品及化妆品等行业[6]。有研究表明,外源施加一定浓度的PPOI可提高小麦种子的发芽率,促进小麦种子萌发及幼苗生长发育[7]。但目前关于施加外源PPOI促进葡萄生长发育,以及导致这种情况的分子机制尚不清楚,有关PPOI应用的研究报道主要集中在食品保鲜[8]、化妆品美白[9]以及相关的药理作用方面[10],在农业促生方面的研究还较少。为了揭示PPOI处理促进“巨峰”葡萄生长发育调控机制,本研究用不同浓度的PPOI处理葡萄,并对其根系和叶片进行转录组分析,为更深入地研究PPOI促进生长发育机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

试验选用16株10年生的“巨峰”葡萄苗(四川农业大学生命科学学院提供),其中4株为对照组,12株作为处理组(2‰、4‰、8‰浓度PPOI)种植于高40cm×宽50cm的营养土中。在观测到植物开始有发芽迹象时,开始添加PPOI,每棵植株2L处理液,对照组加入相同体积的自来水,待处理5次后,取生长速率最好的处理组及对照组的植株叶片和根系进行后续实验,试验发现4‰POOI促生效果最好,之后的实验在此基础上进行。(植株叶片：对照组(Lck)和处理组(L)各3个平行;植株根系：对照组(Rck)和处理组(R)各3个平行)。取完用液氮处理15min,放-80℃保存备用。

1.2 RNA提取和转录组测序

采用RNA提取试剂盒TRIzol Reagent提取葡萄根和叶总RNA,Agilent 2100 Bioanalyzer测定RNA浓度和纯度;通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA,随后通过离子打断的方式将mRNA随机打断。构建cDNA文库并进行质检。将构建好的文库在Illumina测序仪上进行PE150模式测序。测序由上海派森诺生物科技有限公司完成。

1.3 序列数据处理

使用FastQC v0.11.8对测序得到的原始数据进行质量检查。过滤去除3′端带接头的序列;去除平均质量分数低于Q20的Reads。后续所有分析均是基于clean data进行的高质量分析。之后以欧洲葡萄“黑比诺”基因组作为参考基因组,使用利用HISAT2v2.0.5软件将配对末端clean reads与参照基因组进行序列比对。

1.4 基因表达数据分析

采用FPKM对表达量进行标准化,使用DESeq软件(1.20.0)进行PPOI处理根对照组(Rck)和处理组(R),叶对照组(Lck)和处理组(L)之间的差异表达分析。筛选差异表达基因条件为：表达差异倍数|log2FoldChange|>2,显著性P-value<0.05。随后对差异表达基因做GO和 KEGG富集分析。

1.5 差异基因蛋白网络互作分析

依据STRING数据库(https：//string-db.org/)进行蛋白互作分析,揭示目的基因之间的作用关系。

1.6 葡萄产量的测定

于果实成熟期统计单株果穗数后,每个处理(对照组和4‰PPOI处理组)选树冠大小、生长势相近的4株葡萄,每株在树冠的东、南、西、北4个方向各取中等大小果穗2个,迅速运回实验室测定各指标,每处理取样各40 穗。用电子天平称量单穗重并测定单产。

2 结果与分析

2.1 转录组测序数据分析

通过Illumina NovaSeq平台进行双端测序,得到12个样品的原始数据,对这些原始测序数据进行进一步过滤,除去带接头、低质量的Reads,原始数据,样品的clean data百分比在93.44%～93.76%,均在93%以上。由此得出,测序数据质量已达要求,可以进行后续实验。

2.2 表达差异分析

各组间表达量差异分析结果如图1,施加PPOI后,根系中共有1658个基因显著差异,其中有837个基因显著上调;821个基因显著下调(图1a);叶片中共有463个基因显著差异,其中有363个基因显著上调;100个基因显著下调(图1b);基于表达量的聚类热图进一步证实了上述基因的差异表达情况(图1c)。综合结果表明,向根系施加PPOI能够显著引起根系的基因表达响应,且对叶片中的基因表达也有一定程度的影响。

图1 外源施加PPOI后葡萄根系和叶片中的差异表达基因筛选

2.3 差异表达基因GO富集分析

GO富集分析表明,根中差异表达基因的分子功能主要富集在DNA结合的转录活性;细胞组分主要富集在细胞外周;生物学过程主要富集在转录调控-DNA模板和核酸模板转录调控等途径(图2a);叶片中差异表达基因的分子功能主要富集在DNA结合的转录活性;生物学功能主要富集在调节细胞代谢和转录调控-DNA模板化过程(图2b)。综合结论表明,无论是根还是叶片,施加PPOI后影响的主要过程是基因表达的转录调控过程。

图2 外源施加PPOI后的GO功能富集和KEGG通路富集

2.4 差异表达基因KEGG富集分析

KEGG富集分析表明,根中差异表达基因主要参与了淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷生物合成、植物-病原体互作、MAPK信号转导等途径(图2c);叶片中差异表达基因主要参与了半乳糖代谢、植物-病原体互作、内质网蛋白质加工、MAPK信号通路等途径(图2d)。

研究进一步对外源施加PPOI后的葡萄根系和叶片差异表达基因富集的植物激素—信号转导通路进行分析。基于差异表达基因中“植物激素-信号转导”途径的富集结果,列出了基因集中与“脱落酸信号”(3个)、“乙烯信号”(2个)、“磷酸化途径”(1个)和“蛋白激酶”(3个)相关的基因及其功能预测信息(表1)。结果显示,在根系施加PPOI后上述基因的表达模式均有显著性改变。

表1 激素信号转导途径关键富集基因信息

2.5 关键转录因子挖掘

为了深入挖掘施加PPOI后葡萄根系和叶片中具有明显响应的转录调控元件,对差异表达基因进行了转录因子预测(图3)。

图3 外源施加PPOI后葡萄根系和叶片差异表达转录因子筛选

叶片中显著上调的转录因子中,ERF(16个,35.6%)、WRKY(7个,15.6%)、NAC(4个,8.9%)、MYB(3个,3.7%)类转录因子占比最大;根系显著下调的转录因子中,MYB(3个,21.24%)、bHLH(2个,14.3%)、NAC(1个,7.1%)、NF-YB(1个,7.1%)、ERF(1个,7.1%)类转录因子占比最大(图3 a)。

根系中显著上调的转录因子中,ERF(24个,31.6%)、bHLH(6个,7.9%)、MYB(5个,6.6%)、bZIP(5个,6.6%)、NAC(4个,5.3%)类转录因子占比最大;叶片显著下调的转录因子中,ERF(19个,16.8%)、MYB(12个,14.3%)、bHLH(11个,9.7%)、C2H2(10个,8.8%)、NAC(8个,7.1%)类转录因子占比最大(图3 b)。

2.6 共表达网络分析

利用皮尔森相关系数计算基因表达之间的关联,并利用Cytoscape构建共表达网络。输入MYB、bHLH和ERF类转录因子共85个,苯丙烷代谢途径、植物-病原体互作信号转导途径、淀粉-糖代谢途径和光合作用相关基因共51个;生成249对正相关关联基因对和37对负相关关联基因对(图4a)。表明PPOI响应下的转录因子主要通过正向调控途径基因表达产生应答。转录调控网络中,VvERF、VvMYB36、VvbHLH154、bHLH96是参与调控基因数量最多的转录因子;参与核苷酸代谢的核斑点RNA结合蛋白编码基因VvRBP、参与糖类-淀粉代谢途径的葡萄糖1磷酸腺苷基转移酶编码基因VvUDP、参与氧化应激响应的过氧化物酶编码基因VvPOX是受到转录因子调控影响最大的代谢途径关键基因(图4a)。施加PPOI后多种转录因子共同作用增强植物生长发育与抗逆响应网络,促进葡萄植株的生长发育(图4b)。

图4 外源施加PPOI后转录因子与关键途径基因调控网网络挖掘与潜在响应模式

2.7 产量的测定

对4‰PPOI施加后的“巨峰”葡萄与未施加进行产量测定,产量指标包括单穗重和单株穗数及单产。结果显示,施加4‰PPOI能显著提高“巨峰”葡萄单穗重和产量,但对单株穗数提高并不显著,对单产提升约为15%左右(表2)。

表2 PPOI处理后巨峰葡萄产量变化

3 讨论与结论

对施加4‰浓度PPOI处理的葡萄根系和叶片及处理组根系和叶片进行转录组测序分析,发现葡萄根系组织基因中共有1658个基因显著差异,在葡萄叶片组织中共有463个基因显著差异,表明PPOI激活了葡萄植株的代谢。

在GO功能分析中,差异表达基因主要富集在生物学过程中DNA转录调控,在分子功能中主要富集于转录活性及细胞代谢。KEGG富集分析中,参与淀粉和蔗糖代谢,半乳糖代谢、苯丙烷生物合成等代谢途径的基因明显上调。综合GO和KEGG富集结果分析发现,PPOI能增强植株的转录调控以及物质代谢能力,从而发挥促生长的作用。

植物激素在调节植物生长发育和产质量发挥着重要的作用,有研究表明,植物的生长是多种激素相互作用的结果[11]。激素的代谢和信号传导在决定细胞命运、影响转录组、影响蛋白质组、调节细胞周期等方面起着至关重要的作用[12]。本实验中植物激素—信号转导通路富集得到脱落酸信号、乙烯信号、磷酸化途径和蛋白激酶相关基因,表明外源施加PPOI影响了葡萄生长发育激素的产生。从而多种激素共同作用促进葡萄植株的生长。

转录因子是参与真核生物基因表达的重要调控因子,对靶基因的转录活性具有激活/抑制作用[13]。本研究结合转录因子功能和代谢途径富集分析结果推测,乙烯信号响应ERF类转录因子可能参与植物激素与发育调控;MYB、bHLH类转录因子介导苯丙烷-木质素途径代谢调控,从而影响细胞壁发育;综合多途径基因表达调控共同影响葡萄植株在施加PPOI后的生长发育。基于上述结果,我们提出一个PPOI促进葡萄植株生长的模型假说：外源施加PPOI主要影响了葡萄根系和叶片中MYB、bHLH和ERF类转录因子的基因表达,进而调控下游核苷酸代谢(影响细胞增殖)、叶绿体相关基因(影响光合作用)和抗氧化途径基因(影响植物抗逆)的表达。通过增强植物生长发育与抗逆响应网络,共同促进葡萄植株的生长发育。