UPLC-MS/MS 法结合化学计量学分析万氏牛黄清心丸中14 种胆汁酸成分

陈涛，林诗铃，林逸凡，陈雪婷，郑燕芳，黄鸣清（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

万氏牛黄清心丸是由牛黄、黄连、朱砂、栀子、郁金、黄芩共6 味中药材制备而成的中药复方制剂，现收载于《中国药典》（2020年版一部）[1]，具有清热解毒，镇惊安神的功效。临床上用于热入心包、热盛动风证，症见高热烦躁、神昏谵语及小儿高热惊厥。方中的牛黄清心解毒、豁痰开窍，黄连清热燥湿、泻火解毒，为君药。万氏牛黄清心丸以牛黄为君药，决定其质量控制的重点是牛黄及其代用品的质量[2]，牛黄中的胆酸类成分是其主要活性成分，因此对万氏牛黄清心丸中的胆汁酸成分进行定量研究具有重要意义。牛黄含有甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、鹅去氧胆酸等多种胆汁酸[3-5]。药理研究[6-9]表明，胆汁酸类成分具有保肝、利胆、降压、抗炎、解热、镇痛等作用。万氏牛黄清心丸现行标准对牛黄质控只规定其胆红素含量的测定[1]，相关报道[10]也仅对胆红素含量进行测定。因此建立万氏牛黄清心丸中胆汁酸成分的含量测定方法对评价其质量具有重要意义。超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）具有分析速度快、效率高、检测灵敏度高等特点，在中药分析以及质量控制领域的应用越来越多[11-12]。故本实验采用UPLC-MS/MS 法同时测定万氏牛黄清心丸中牛磺胆酸、7-酮脱氧胆酸、甘氨胆酸、3-氧代脱氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸钠、胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺石胆酸钠、甘氨石胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸的含量，同时以化学模式识别法对其含量测定结果进行评价，以期为万氏牛黄清心丸的质量控制提供新的依据。

1 材料与试药

1.1 仪器DIONEX UITIMATE 3000 超高效液相色谱系统串联四级杆-静电轨道肼质谱仪（美国赛默飞世尔公司），配备加热电喷雾离子源（HESI）；MILLI-Q Direct16 超纯水制备仪（美国Millipore 公司）；CPA225D 十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；XM-400UHP 小美静音超声仪（昆山小美超声仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂甘氨胆酸（批号：Y08A9E57765）、3-氧代脱氧胆酸（批号：N07GY167164）、牛磺鹅去氧胆酸（批号：Y09S8K43540）、胆酸（批号：T16J8Q28663）、甘氨鹅脱氧胆酸（ 批号：Y29M9K57235）、甘氨脱氧胆酸（批号 ：Y27M9E56969）、鹅去氧胆酸（批号：Z01011LA14）、甘氨石胆酸（批号：B29J11K119775）、去氧胆酸（批号：S05N6I5476）、石胆酸（批号：B24S10J98701）、脱氢胆酸（批号：S30J9I64022）、7-酮脱氧胆酸（批号N30GB169735），经HPLC 测定，纯度均大于98%，牛磺胆酸（纯度≥95%，批号：B15J11J118403）、牛磺石胆酸钠（纯度≥97%，批号：Y06N9K74072），以上对照品均为上海源叶生物科技有限公司产品；牛磺脱氧胆酸钠（批号：B26J9J53831），美国Sigma-Aldrich 公司，经HPLC 测定，纯度≥95%。质谱甲醇为LC-MS级（美国赛默飞世尔公司），甲酸为HPLC级（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），其余试剂均为分析纯。万氏牛黄清心丸[S1，批号：200002；S2，批号：190006；S3，批号：200003，S4，批号：210001；S5，批号：210002；S6，批号：201005；S7，批号：210006；S8，批号：210007；S9，批号：220002；S10，批号：220003，S11，批号：210005；S12，批号：210008；S13，批号：190008；S14，批号：210003；S15，批号：210004，国药集团冯了性（佛山）药业有限公司]。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件

2.1.1色谱条件 Thermo Fisher Scientfic Bremen Hypersil GOLD 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～0.5 min，20%A；0.5～1.5 min，20%A～70%A；7～8 min，70%A～61%A；8～14 min，61%A～80%A；14～15 min，80%A～85%A；15～16 min，85%A～90%A；16～17.5 min，90%A～20%A；17.5～19 min，20%A）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：2 μL。

2.1.2质谱条件 采用加热电喷雾离子源（HESI）负离子模式，喷雾电压：-3.0 kV，毛细管温度：325 ℃，辅助气加热温度：350 ℃，鞘气流速：45 Arb，辅助气流速：10 Arb，质谱测定数据采用平行反应监测（PRM）扫描模式，各待测成分及内标物的质谱优化参数见表1，对照品溶液及供试品溶液中各成分的色谱图见图1。

图1 万氏牛黄清心丸中14 种胆汁酸成分UPLC-MS/MS 色谱图Figure 1 UPLC-MS/MS chromatogram of 14 cholic acids in Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

表1 万氏牛黄清心丸各待测成分及内标物的质谱优化参数Table 1 Optimum parameters of mass spectrum for each component in Wanshi Niuhuang Qingxin Pills and internal standard

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液及内标溶液的配制 分别精密称取14种对照品，用甲醇溶解配制为2 mg·mL-1的单一对照品母液。分别精密量取各对照品母液适量，用甲醇稀释，即得混合对照品溶液。精密称取脱氢胆酸对照品（内标）适量，用甲醇溶解配制为浓度2 mg·mL-1的内标母液，用甲醇溶液稀释至浓度为20 ng·mL-1的内标溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取万氏牛黄清心丸0.1 g，加入10 mL 甲醇，超声提取30 min 后，放冷，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取适量供试品溶液，置于棕色进样瓶中，按1∶1体积比加入内标溶液，得到含有内标10 ng·mL-1的供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系及定量限考察 精密量取“2.2.1”项下混合对照品母液，用甲醇稀释制成一系列浓度的混合对照品溶液，按照1∶1体积比加入内标溶液，得各浓度的标准曲线待测对照品混合溶液。按“2.1”项下条件进样测定，考察待测物和内标的峰面积比（Ai/As）与待测物浓度（C）的线性关系，用Ai/As 对待测物浓度绘制标准曲线，建立回归方程。以信噪比S/N≈3 和S/N≈10 分别作为各对照品的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。结果见表2。

表2 万氏牛黄清心丸待测成分的线性方程Table 2 Linear equation of tested components in Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.3.2精密度试验 精密量取混合对照品溶液适量，制备成各成分浓度依次为640.0、40.0、414.0、5.0、31.0、141.0、1740.0、23.0、103.0、2.0、0.8、42.0、412.0、3.0 ng·mL-1的对照品混合液，对半稀释两次，得到低、中、高浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下条件连续重复进样测定6次，测定日内精密度，连续测定3 d，测定日间精密度。结果见表3。计算得到14 种成分的日内精密度RSD 在1.12%～4.56%之间，日间精密度RSD 在0.59%～4.43%之间，表明仪器精密度良好。

表3 万氏牛黄清心丸的精密度、稳定性、重复性试验结果Table 3 Test results of precision，repeatability and stability of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.3.3稳定性试验 精密称取万氏牛黄清心丸（S1）0.1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件，于0、2、4、6、8、12、24、48 h进样测定。结果见表3。计算得到14种成分峰面积的RSD在1.25%～4.33%之间，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.4重复性试验 取同一批万氏牛黄清心丸（S1），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，通过标准曲线计算得到各成分浓度及其RSD。结果见表3。14 个成分RSD 在0.73%～4.50%之间，表明该方法重复性良好。

2.3.5加样回收率试验 精密量取已知成分含量的万氏牛黄清心丸（S1）0.05 g，平行9 份，分别加入约相当于供试品50%、100%、150%含量的14种成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积，计算14 种成分的平均加样回收率及其RSD。结果见表4。平均加样回收率在95.6%～103.6%之间，RSD 在0.52%～4.62%之间。

表4 万氏牛黄清心丸的加样回收率试验结果（±s，n=3）Table 4 Test results of recovery rate of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills（±s，n=3）

表4 万氏牛黄清心丸的加样回收率试验结果（±s，n=3）Table 4 Test results of recovery rate of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills（±s，n=3）

化合物牛磺胆酸样品含量/μg 16.01化合物甘氨鹅脱氧胆酸样品含量/μg 0.59 7-酮脱氧胆酸1.00甘氨脱氧胆酸2.58甘氨胆酸10.36牛磺石胆酸钠0.05 3-氧代脱氧胆酸0.13甘氨石胆酸0.02牛磺鹅去氧胆酸0.78鹅去氧胆酸1.06牛磺脱氧胆酸钠3.52去氧胆酸10.29胆酸43.49加入量/μg 8.00 16.01 24.01 0.50 1.00 1.51 5.18 10.36 15.54 0.06 0.13 0.19 0.39 0.78 1.16 1.76 3.52 5.29 21.75 43.49 65.24测得量/μg 23.78±0.097 31.83±0.075 39.55±0.383 1.50±0.011 1.99±0.027 2.56±0.056 15.81±0.085 20.84±0.298 25.43±0.184 0.19±0.001 0.26±0.003 0.32±0.009 1.17±0.018 1.51±0.016 1.98±0.017 5.33±0.024 6.90±0.112 8.83±0.234 66.40±0.336 86.55±0.686 106.54±1.528平均回收率/%97.1±1.2 98.8±0.5 98.0±1.6 97.8±2.3 97.8±2.7 103.1±3.7 103.2±1.6 101.1±2.9 96.9±1.2 103.3±1.1 101.7±2.5 100.5±4.5 101.9±4.7 95.6±2.1 103.6±1.4 102.7±1.3 95.7±3.2 100.3±4.4 103.3±1.5 99.0±1.6 96.6±2.3 RSD/%1.21 0.52 1.64 2.35 2.73 3.64 1.64 2.81 1.22 1.11 2.41 4.54 4.62 2.21 1.41 1.34 3.38 4.49 1.55 1.64 2.47石胆酸0.07加入量/μg 0.29 0.59 0.88 1.29 2.58 3.87 0.03 0.05 0.08 0.01 0.02 0.03 0.53 1.06 1.59 5.14 10.29 15.43 0.03 0.07 0.10测得量/μg 0.87±0.015 1.16±0.024 1.46±0.048 3.90±0.049 5.21±0.094 6.20±0.098 0.07±0.001 0.10±0.002 0.13±0.003 0.03±0.001 0.04±0.001 0.05±0.001 1.58±0.016 2.08±0.011 2.62±0.029 15.59±0.268 20.23±0.327 25.81±0.602 0.10±0.001 0.14±0.003 0.18±0.003平均回收率/%97.7±5.0 98.7±4.2 99.9±5.4 102.5±3.8 102±3.6 95.7±2.5 95.6±1.6 96.6±3.1 100.6±4.0 97.9±3.5 102.3±2.4 101.3±3.2 98.5±3.0 96.4±1.1 98.3±1.8 103.1±5.2 96.7±3.2 100.6±3.9 96.0±2.5 102.1±5.0 100.8±2.5 RSD/%3.17 4.25 4.55 3.71 3.62 2.73 1.74 3.32 3.94 3.51 2.44 3.17 3.19 1.14 1.91 3.12 3.34 3.91 2.74 4.61 2.51

2.4 含量测定分别精密称取不同批次的万氏牛黄清心丸适量，按“2.2.2”项下的方法制备样品，以“2.1”项下条件进样测定，根据内标法计算各批次万氏牛黄清心丸中14种化合物的含量。结果见表5。

表5 15 批万氏牛黄清心丸中14 种成分含量测定（n=3）Table 5 Determination of 14 components content in 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills（n=3）

2.5 化学计量学分析

2.5.1聚类分析 为考察不同批次万氏牛黄清心丸之间的成分含量差异性，采用SPSS 26.0 软件，以所测得的15批万氏牛黄清心丸中14种胆汁酸成分含量为变量，用瓦尔德法进行聚类分析。结果见图2。15批药材可聚为2 类，其中S12、S14、S15 聚为一类，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S13 聚为一类，可见不同批次样品成分存在一定的差异。

图2 15 批万氏牛黄清心丸的聚类分析Figure 2 Cluster analysis of 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.5.2主成分分析（PCA） 采用SPSS 26.0软件对不同批次的万氏牛黄清心丸中14 个胆汁酸成分含量进行主成分分析。前3 个主成分累计方差贡献率达到91.622%，说明3 个主成分能充分体现万氏牛黄清心丸样品的原始变量信息。以前3 个主成分进行投影，计算不同批次的万氏牛黄清心丸的综合评价得分，用于分析单个样品在整体中的分布情况，将综合评价得分导入SIMCA 14.1 软件中，绘制主成分分析图。见图3。

图3 15 批万氏牛黄清心丸的PCA 散点得分图Figure 3 PCA scatter scores of 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.5.3正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA） 为分析不同批次万氏牛黄清心丸之间各胆汁酸成分含量的相似性和差异性，筛选出其差异标志物，采用SIMCA 14.1 软件对14 种胆汁酸成分含量建立OPLSDA 模型。见图4-A。该模型中自变量拟合指数（R2x）为0.909，因变量拟合指数（R2y）为0.932，模型预测指数（Q2）为0.841，R2和Q2都超过0.5，表示模型拟合结果可被接受[13]。通过置换检验，置换次数为200验证该模型是否过拟合。见图4-B。结果Q2回归线截距小于0，说明模型不存在过拟合，表明模型有效，认为其结果可用于分析不同批次万氏牛黄清心丸之间的差异性。同时，计算不同成分的VIP值。见表6。

图4 15 批万氏牛黄清心丸的OPLS-DA 得分图（A）和模型交叉验证结果（B）Figure 4 OPLS-DA score chart （A）and model cross validation results（B）of 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

3 讨论

3.1 色谱条件的选择比较了Acauity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm.1.7 μm）、Themo Bremen Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）等色谱柱。结果Thermo Bremen Hypersil GOLD 对样品中胆汁酸成分的保留和分离效果较好，峰型尖锐，能实现对万氏牛黄清心丸中14种胆汁酸成分的快速、有效的分离。

本研究还比较了不同流动相体系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水）对色谱图峰型及各待测成分间分离的影响。用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相时，色谱图的峰型较好，无拖尾现象，万氏牛黄清心丸各成分的分离度及响应值也较好。

3.2 质谱条件的优化本研究内标物选择脱氢胆酸，脱氢胆酸与本研究中测定的14 个胆汁酸成分具有相同的胆烷酸母核，且在万氏牛黄清心丸样品中未检出该成分，与其他化合物之间不存在基质效应，不会对测定结果产生影响，故选择脱氢胆酸作为内标物进行测定。

同时，比较了在正、负离子扫描模式下，14 种胆汁酸成分的响应强度。结果发现在负离子模式下各成分响应丰度高，且在PRM 扫描模式下，通过改变碰撞能量，可筛选出响应较高的碎片离子作为定量子离子。

3.3 化学计量学分析通过对不同批次万氏牛黄清心丸中的14 种胆汁酸成分含量进行测定，发现各批次样品之间的胆汁酸成分含量有一定的差异。聚类分析可将所有批次样品聚为两类，S12、S14、S15聚为一组，其他批次样品聚为一组。进一步对各成分含量进行主成分分析，主成分分析散点得分图中，不同批次样品在图上呈分散状，根据样品散点之间距离，S12、S14、S15归为一组，其他批次样品归为一组。结果与聚类分析结果一致。采用OPLS-DA 方法，以P＜0.05，VIP ≥1 为条件筛选不同批次万氏牛黄清心丸差异成分，获得牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸、去氧胆酸、胆酸等9 个成分。根据含量测定的结果，9 个差异性成分中牛磺胆酸、甘氨胆酸、去氧胆酸、胆酸等成分的含量较高，占成分总量的89%以上，它们的质量分数分别为217.08～664.53、119.79～334.06、767.89～983.58、146.32～263.03 μg·g-1。依据本次测定的万氏牛黄清心丸样品结果，若本品每丸含有的牛黄以牛磺胆酸、甘氨胆酸、去氧胆酸、胆酸总量计，则每丸中牛黄含量范围为159.8～430.8 mg。药理研究[6，14]表明，牛磺胆酸、甘氨胆酸、去氧胆酸、胆酸具有保肝、利胆、抗炎等功效。因此，其可作为差异性指标成分对不同批次万氏牛黄清心丸进行区分。

本研究结果显示，同一厂家中的不同批次产品在含量上存在较大差异，其原因可能是不同批次产品中的牛黄存在质量差异，导致了最终成药检测时的差异。建议将差异性化合物（牛磺胆酸、甘氨胆酸、去氧胆酸、胆酸）作为评价指标建立质量控制体系，从而监测制剂的批间质量差异。

本研究基于UPLC-MS/MS技术建立了同时测定万氏牛黄清心丸中14 种胆汁酸成分的定量分析方法，该方法灵敏度高、专属性好，在19 min 内可对胆汁酸成分进行分离，可用于万氏牛黄清心丸的胆汁酸成分的测定，为其质量评价提供参考。不同批间样品胆汁酸成分含量存在一定的差异，牛磺胆酸、甘氨胆酸、去氧胆酸、胆酸可作为产品质量的差异性指标成分监控其质量。