针刺调控铁死亡治疗脑卒中的信号通路研究进展

秦文秀 许军峰 高 莹 王坪霏 杨 婷 杜健强

(1 天津中医药大学第一附属医院,天津,300381; 2 国家中医针灸临床医学研究中心,天津,300381; 3 天津中医药大学,天津,301617; 4 甘肃中医药大学,甘肃,兰州,730000)

脑卒中,中医称中风,因起病突然、病因复杂,病情演变迅速,与风邪善行数变的特性极为相似。中风首见于《金匮要略·中风历节病脉证并治第五》:“夫风之为病,当半身不遂,或但臂不遂者,此为痹,脉微而数,中风使然。”[1]临床主要表现为突然昏仆、不省人事、半身不遂、口眼斜和言语不利等症状。中风的病因病机较复杂,《黄帝内经》中记载很多,但归纳起来不外乎火、风、痰、瘀、虚、气等,以上病理因素在一定条件下相互作用而发病[2]。脑卒中是全球第2大导致人类死亡的疾病,指由供血血管突然闭塞或出血引起的一系列疾病,所以又将脑卒中分为缺血性卒中和出血性卒中[3],其中缺血性脑血管病占多数[4]。现代医学认为,脑卒中病理机制涉及脑血管破裂或脑血流中断引发神经炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、自噬和细胞毒性等复杂过程,这些病理学改变导致神经元、胶质细胞和内皮细胞的显著损伤,所有这些都是脑损伤的核心节点[5]。脑卒中一旦发生,脑组织得不到足够的血液供应后,就会发生一系列的病理动态演变过程,最终会导致神经元的急性坏死和神经元的迟发性死亡,从而出现一系列临床症状[6]。针刺治疗脑卒中已有数千年历史,针刺的双向调节能激活兴奋性、氧化应激、炎症反应、神经元死亡和存活的多种分子和信号通路,通过抑制炎症反应、脑水肿形成、细胞凋亡,减轻氧化应激损伤,促进神经与血管再生;改善脑部血液循环及血流流变学异常;提高脑损伤区域神经细胞的功能和机体免疫功能以及改善甲皱微循环等来缓解和治疗脑卒中及其并发症、后遗症[7-8]。目前针刺治疗脑卒中的作用机制研究主要集中在蛋白表达和单通道方面,然而有关蛋白表达的相互作用及多种信号转导通路调控的证据并不多,所以需要对其信号通路进行全面分析。

近年来,铁死亡成为医学研究的高频词,有关铁死亡诱导并伴随多种疾病发生发展的研究层出不穷,而铁死亡被证明是一种受调控的铁依赖的非凋亡细胞死亡,参与了脑卒中后脑组织及神经元损伤,铁死亡抑制剂也在一些缺血性或出血性的脑卒中实验研究中得到证实[3]。这些发现揭示了神经保护的新机制,并强调了脑卒中过程中铁死亡扮演的重要角色。正因如此,研究者对针刺与铁死亡相关性进行了研究,以发现针刺治疗脑卒中的作用机制。现通过搜集整理相关文献,总结探析针刺抑制铁死亡治疗脑卒中的信号通路,以完善针刺治疗脑卒中的作用机制,进一步推广其临床应用。

1 铁死亡

铁死亡(Ferroptosis)与细胞凋亡、坏死和自噬不同,是一种由依赖铁的脂质过氧化物过度积累引起的细胞调控死亡新形式[9]。在形态特征上,与其他细胞死亡不同,铁死亡表现为细胞增大,线粒体体积减少,线粒体膜密度增加,线粒体嵴缺失或减少等[10]。在生物化学特征上,铁死亡表现为细胞内Fe2+和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的升高发生芬顿反应,半胱氨酸摄入量的减少,谷胱甘肽的耗竭,羟基、羟基自由基和脂质氢过氧化物的水平升高,生物膜中多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应等[11]。在机制及调节方式上,铁死亡主要涉及铁代谢、氨基酸代谢和脂质代谢3个方面[12]。铁死亡不仅与阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson Disease,PD)和缺血性脑卒中等神经退行性疾病的发生发展有关,也与病理性细胞变性和死亡相关[9,11,13]。

2 铁死亡与脑卒中

2.1 铁死亡与脑卒中的关系 铁死亡作为一种可调节的细胞死亡,已经被证实介导了脑卒中患者的神经元退变和损伤,且铁抑素对改善损伤有明显的效果[14]。脑卒中时铁死亡的发生与增加细胞内Fe2+和脂质过氧化物的含量有关,抑制铁死亡能减轻脑卒中损伤,提示铁死亡介导了脑卒中的损伤,成为了干预脑卒中的潜在靶点[15]。首先,脑缺血后通过抑制tau蛋白的表达致铁积累,tau蛋白与神经元结合从而促进铁外流。然后,过量的铁通过血脑屏障进入脑实质,通过芬顿反应促进ROS的生成,从而促进核酸、蛋白质和膜损伤,最终引发相关的神经细胞死亡[16]。MAGTANONG和DIXON在单侧短暂性大脑中动脉阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)的背景下进行了铁死亡和脑缺血的相关实验研究,表明MCAO导致受损半球铁含量升高,这种铁过度积累可能诱发铁死亡[17]。由于脑出血后细胞裂解,大量释放血红蛋白,损伤部位激活的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞吞噬并降解血红蛋白,进一步释放亚铁,这种亚铁在神经元中积累,并作为催化剂,通过芬顿反应形成羟基自由基,驱动ROS的产生。当谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)活性被抑制时,脂质过氧化和铁死亡就会发生[18]。见图1。更重要的是,脑卒中后受损组织中铁含量明显升高,而且用以前的方法(如阻断兴奋性毒性)并不能逆转,可能是因为它们没能阻断铁死亡,神经细胞进一步受损。铁死亡抑制剂,如铁死亡抑制剂Ferrostatin-1和Liproxstatin-1,在脑卒中后应用中显示了很好的神经保护作用[19]。这些结果有力地证明,铁死亡的确在脑卒中和脑卒中后神经元损伤中发挥了重要作用,有望成为逆转脑卒中神经功能缺损和改善预后的新靶点。

2.2 中医药干预铁死亡的研究 中医药以其多组分、多通路、多靶点的作用特点,可同时调节细胞死亡的多种形式以治疗脑卒中。大量研究从分子机制角度论证了中药单药或复方活性成分及针刺、艾灸等中医治疗手段能通过调节铁死亡而发挥神经保护作用。中药单药包括黄芩、山豆根、虎杖、钩藤、地黄、丹参、三七、红花、牡丹皮、姜黄、远志、人参、白果、枇杷叶、余甘子、葛花、槐角、麻黄根、女贞子、沙棘、天麻等[20];中药复方或中成药包括醒脑静注射液、大株红景天注射液、脑泰方、安脑平冲方、补肾活血颗粒以及补阳还五汤等[21-22]。中药在这方面的研究较多且主要着眼于GPX4、缺氧诱导因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-1)、铁转运蛋白1(Ferroportin 1,FPN1)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)等具有氧化防御作用的调节通路,作用于多个相关靶点,通过增强细胞抗氧化作用,调节铁代谢,减少细胞铁内流,弱化铁的介导作用,从而干预铁死亡[23]。但中药药物种类丰富,复方构成药理复杂,调控铁死亡的药物研究仍处于起步阶段,若想完全厘清何种药物及提取物干预了铁死亡对应具体靶点或通路,针对性用药尚有很长一段路要走。非药物疗法通过铁死亡途径干预脑卒中的研究数量较少,目前主要集中在针刺方面。针刺通过调控铁死亡相关信号通路,调节神经细胞铁代谢蛋白的表达,减少脑组织铁沉积,从而减轻脑卒中后铁死亡引起的脂质过氧化损伤,抑制神经细胞铁死亡,达到神经保护作用,改善运动功能障碍,并降低脑梗死程度[24-25]。电针已被证明可以通过上调FPN1、GSH、GPX4的表达和下调HAMP(铁调素基因)的表达减轻脑卒中后的组织铁负荷,减少铁介导的氧化应激,同时促进线粒体修复,进而发挥抑制铁死亡的作用,并在脑卒中后的急性期、亚急性期发挥神经保护作用[26]。总之,虽然通过中医药干预铁死亡治疗脑卒中是一个新方向,有望为治疗脑卒中提供新靶点,但是相关研究文献相对较少,且大部分研究基于动物实验,临床试验数据相对较少。

以下我们着重讨论针刺调控铁死亡治疗脑卒中的信号通路。

3 针刺调控铁死亡治疗脑卒中的信号转导通路

3.1 miR-23a-3p和NFE2L2信号通路 核转录因子红系2样2(Nuclear Factor,Erythroid 2 Like 2,NFE2L2)是一种主要的抗氧化调节因子,在铁死亡通路中发挥着重要作用[27]。NFE2L2信号通路是一种抗氧化途径,可以驱动和调节细胞内与ROS水平有关的酶来调节铁死亡的发生,针刺可以明显激活NFE2L2信号通路以抵抗脑卒中出现的脑损伤。值得注意的是,miR-23a-3p的结合位点存在于NFE2L2中。下调miR-23a-3p对脑出血后的退行性神经元数量、炎症反应和铁死亡均有抑制作用,并能够激活NFE2L2信号通路。针刺可通过降低miR-23a-3p的表达,使NFE2L2易位增加、血红素氧合酶-1和GPX4表达增加、铁和ROS积累减少,从而缓解脑卒中导致的神经功能缺损[28]。

3.2 p62/Keap1/Nrf2信号通路 Sequestosome 1/p62是一种主要参与各种蛋白的运输、降解和破坏的衔接蛋白。Keap1依赖的降解泛素化是一个控制Nrf2的过程。Nrf2是氧化应激的关键调节因子,并作为抗氧化剂保护细胞免受铁死亡[29]。然而,在氧化应激过程中,p62与Keap1和Nrf2的结合位点结合,从而竞争性地阻止Keap1与Nrf2的结合,并产生Nrf2累积。可以推测,针刺干预可通过触发抗氧化通路p62/Keap1/Nrf2,并导致FTH1和GPX4上调,这些因子参与减少铁超载,减轻脑卒中后铁死亡引起的脂质过氧化损伤,从而加快脑卒中后的恢复[30]。有证据表明,在脑卒中后针刺干预可通过促进p62/Keap1/Nrf2抗氧化信号通路来保护脑组织,而p62/Keap1/Nrf2抗氧化信号通路是通过Nrf2的转录刺激来调控铁死亡的,这与ROS和铁稳态有关[31]。脑卒中后针刺治疗可使p62、Nrf2、GPX4和FTH1的表达增多,Keap1的表达减少,从而减少神经细胞体内线粒体收缩,增加线粒体外膜直径,抑制神经元死亡,减少脑卒中后神经行为异常。

3.3 α7nAChR介导的JAK2/STAT3信号通路 针刺治疗可通过α7亚基的烟碱型乙酰胆碱受体(α7 Nicotinic Acetylcholine Receptor,α7nAChR)介导的Janus激酶2(Janus Kinase,JAK2)/信号转导及转录激活因子3(Signal Transducers and Activators of Transduction 3,STAT3)信号通路减轻慢性脑低灌注后的认知缺陷,提供强大的神经保护并抑制炎症介质的释放[32]。α7nAChR是一种表达于中枢和外周神经系统的配体门控离子通道,主要参与调节炎症反应。α7nAChR激动剂能够抑制炎症介质的释放,保护神经元免受多种脑损伤,特别是缺血损伤。针刺通过激活α7nAChR及其下游JAK2/STAT3通路促进大脑低灌注后认知功能恢复,并具有抗炎和神经保护作用。此外,α7nAChR通过激活细胞内JAK2的信号转导和STAT3的信号表达来调节炎症反应,这为针刺治疗脑卒中提供了新的见解。CHEN等[33]经研究证实STAT3是铁死亡的重要调节因子,调控STAT3表达能诱导或抑制铁死亡。

3.4 cAMP/PKA/CREB信号通路 海马在记忆的形成中起着重要的作用,海马一旦病变,则会出现中度可靠的顺行性记忆损害。环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)/cAMP依赖性蛋白激酶A(cAMP-dependent Protein Kinase,PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(cAMP Response Element-binding Protein,CREB)通路参与了针刺增强认知的作用,该通路的激活对实现针刺改善认知功能至关重要。针刺可通过上调cAMP/PKA/CREB信号通路改善海马功能,逆转脑卒中高频刺激下突触强度长时程增强(Long-term Potentiation,LTP)受损,这是针刺改善脑卒中认知功能的一种分子机制[34]。WANG等[35]提出CREB能刺激GPX4转录抑制铁死亡,而脑卒中伴随着铁死亡,故cAMP/PKA/CREB信号通路可能是针刺调控铁死亡治疗脑卒中的通路之一。

3.5 PI3K/AKT信号通路 磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositol 3 Kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)信号通路通过抑制B细胞淋巴瘤蛋白2(B Cell Lymphoma Protein-2,Bcl-2)/Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)的比值发挥抗细胞死亡作用。针刺通过激活PI3K/AKT信号通路促进大鼠脑梗死(Cerebral Infarction,CI)后神经血管单元的修复,从而对神经血管单元起到保护作用[36]。针刺可激活PI3K/AKT通路,增加缺血脑组织中PI3K激活因子脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor,GDNF)的血清分泌水平,上调抗凋亡Bcl-2/Bax比值,从而保护神经,抑制脑细胞死亡[37]。LIU等[38]发现激活PI3K/AKT通路可以减轻或抑制铁死亡。因此,通过针刺激活PI3K/AKT信号通路抑制脑细胞死亡是一种很有前景的脑卒中治疗策略。

3.6 p38 MAPK信号通路 p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated Protein Kinases,p38 MAPK)信号转导通路与脑损伤及缺血耐受密切相关。在脑损伤等病理条件下,谷氨酸过度释放到突触间隙,激活含nr2b的抗N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基2B(N-methyl-D-aspartate(NMDA)Receptor Subunit 2B,GluN2B),使细胞内钙超载,超载的钙会激活细胞质中的m-钙蛋白酶,进而诱导STEP61的酶反应,抑制p38 MAPK的去磷酸化,最终通过信号转导导致细胞死亡[39]。铁死亡是一种氧化应激损伤,p38 MAPK信号通路的激活参与了氧化应激损伤和突触可塑性损伤[40]。针刺表现出对p38 MAPK通路的双重调节功能,减少β淀粉样蛋白在大脑中的沉积,改善患者的学习和记忆能力,有助于多种神经系统疾病的临床症状和功能的全面改善[41]。针刺能有效下调反应性星形细胞,为脑卒中提供神经保护,其机制可能是激活p38 MAPK/CREB信号通路,从而阻止缺血皮质半暗区第2个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂(Second Mitochondria-derived Activator of Caspase/Direct Inhibitor of Apoptosis Protein(IAP)-binding Protein With Low PI,Smac/Diablo)易位,恢复X染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-linked Inhibtor of Apoptosis Protein,XIAP)介导的胱天蛋白酶(Caspase-3)抑制[42]。

3.7 BDNF介导的Nrf2信号通路 BDNF在星形胶质细胞中调节氧化还原敏感转录因子Nrf2以及星形胶质细胞与神经元之间的代谢中发挥关键作用。星形胶质细胞-神经元相互作用的失调和星形胶质细胞Nrf2激活不足可能导致神经元特别是多巴胺能神经元的铁死亡。BDNF在星形胶质细胞与神经元的相互作用,星形胶质细胞Nrf2表达以及线粒体活性的调控中发挥关键作用[43]。针刺可以通过刺激ATP激活单核细胞,增加BDNF的表达,从而激活Nrf2抑制铁死亡保护神经[44]。BDNF介导的Nrf2信号通路和神经营养蛋白家族在针刺诱导的神经保护中发挥着关键作用,这将为针刺治疗脑卒中的本质提供重要的见解。

3.8 PGC-1α/TFAM信号通路 大脑是一个高能量消耗的器官,在很大程度上依赖三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP),ATP负责提供能量以维持大脑功能,一旦ATP耗尽,大脑中的细胞损伤可导致细胞死亡。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(Peroxisome Proliferator-activated Receptorγ Coactivator-1α,PGC-1α)/线粒体转录因子A(Mitochondrial Transcription Factor A,TFAM)通路是线粒体呼吸功能的重要分子机制。铁死亡引起细胞死亡的中心是由TFAM下调介导的,TFAM可作为一种铁死亡的拮抗剂[45]。针刺对MCAO大鼠缺血损伤有一定的保护作用,能增加脑卒中大鼠ATP释放和保存,最终改善神经缺陷和运动功能障碍,这种作用可能受到PGC-1α/TFAM信号通路激活的正调控[46]。

3.9 Notch信号通路 Notch信号是一类高度保守的信号转导通路,参与调节几乎所有组织和器官中的细胞增殖、分化和凋亡[47]。研究已证实在腰椎间盘突出症中,突出髓核的新生血管可能使组织暴露于高水平的血红素中,从而激活Notch通路诱发细胞毒性和铁死亡,加速突出髓核的进行性退变,可见Notch通路也参与了铁死亡的发生[48]。中枢神经系统中存在Notch信号转导通路中的相关基因和蛋白质表达[49]。TAN等[31]发现针刺可有效抑制大鼠基底节Notch1和Hes1蛋白的表达,这些抑制作用与Notch信号通路抑制剂DAPT的作用相同。针刺治疗可激活Notch3信号通路,从而促进Notch3及下游Hes1基因表达,抑制海马神经元凋亡,该结果为脑卒中的治疗提供了新的分子靶点[50]。针刺通过抑制脑卒中后大鼠基底节Notch/Hes信号通路,增强神经细胞修复能力,从而维持神经干细胞的增殖,对脑卒中具有神经保护作用。

4 总结

综上所述,针刺治疗脑卒中的信号转导通路涉及多个信号通路,包括miR-23a-3p和NFE2L2信号通路、p62/Keap1/Nrf2信号通路、α7nAChR介导的JAK2/STAT3信号通路、cAMP/PKA/CREB信号通路、PI3K/AKT信号通路、p38 MAPK信号通路、PGC-1α/TFAM信号通路、Notch信号通路和BDNF介导的Nrf2信号通路。其中miR-23a-3p和NFE2L2信号通路已有研究明确指出针刺调控铁死亡治疗脑卒中是通过该通路实现的。而p62/Keap1/Nrf2、α7nAChR介导的JAK2/STAT3、cAMP/PKA/CREB、PI3K/AKT、p38 MAPK、PGC-1α/TFAM、Notch和BDNF介导的Nrf2信号通路,这些通路虽然既参与了针刺治疗脑卒中的过程,又可以调控铁死亡,但目前并没有研究明确指出这些通路是针刺调控铁死亡治疗脑卒中的信号通路,这有望成为研究针刺治疗脑卒中机制的一个新方向。除此之外,针刺治疗脑卒中及其并发症还可以通过其他信号通路来实现,如GluN2B/m-钙蛋白酶、皮质p-胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase,ERK)、视黄酸(Retinoic Acid,RA)、巨噬细胞诱导的C型凝集素(Macrophage-induced C-type Lectin,Mincle)/脾酪氨酸激酶(Spleen Tyrosine Kinase,Syk)、Toll样受体4(Toll-like Receptor 4,TLR4)等信号通路[51-54],但这些通路是否通过参与调控铁死亡来治疗脑卒中,尚待进一步研究。总之,针刺调控铁死亡治疗脑卒中是一种新机制,铁死亡这一概念在脑卒中疾病中的研究可能给脑卒中的发病机制和治疗靶点的寻找提供新思路。

利益冲突声明:无。