茶树功能性成分的遗传多样性分析及综合评价

刘梦月, 孙 悦, 韦朝领, 宋 博, 陈志丹, 曹士先, 孙威江,①

(1. 福建农林大学安溪茶学院, 福建 泉州 362400;2. 福建农林大学: a. 海峡两岸特色作物安全生产省部共建协同创新中心, b. 园艺学院, 福建 福州 350002;3. 安徽农业大学 茶树生物学与资源利用国家重点实验室, 安徽 合肥 230036; 4. 武夷星茶业有限公司, 福建 武夷山 354301)

茶树〔Camelliasinensis(Linn.) O. Ktze.〕为多年生常绿木本经济作物,起源于中国,且种质资源较为丰富。由茶树鲜叶制作而成的茶,在中国被称为“国饮”,具有独特风味,营养、保健功效也受到大众认可[1],如茶多酚具有抗菌、抗炎和抗氧化功效[2-3],咖啡碱具有兴奋、利尿、强心、消化和解毒作用[4],游离氨基酸具有镇静、保护神经和提高认知力等作用[5]。茶树的品质特征和保健功效成分与其鲜叶密切相关[6-7]。

种质资源丰富度与品种改良和新品种培育有直接关系[8],其中,遗传多样性是生物多样性的重要组成,也是种质资源筛选的基础[9]。目前,基于表型性状对茶树种质资源遗传多样性的研究已有较多报道,在相同生境条件下,该方法简单,易于操作,分析结果准确、稳定,在一定程度上可为遗传育种选材提供参考。如段志芬等[10]利用农艺性状多样性对云南大理茶种质资源进行了分析;冯花等[11]对不同地区茶树种质资源的数量、质量性状遗传多样性进行了研究;王新超等[12]对广西不同茶树种质资源的主要生化成分进行了遗传多样性分析。目前,对福建省适制乌龙茶的茶树功能性成分的遗传多样性研究缺乏系统报道,有待补充和完善。近年来,以功能性育种为目标的研究已成为国内外关注的热点[13-14]。很多学者已开展茶叶化学成分的功能评价研究,如林金科等[15]认为高酯型儿茶素茶树种质资源可作为品质遗传改良的重要材料;赵洋等[16]对高氨基酸茶树种质资源进行了筛选,从75份黄金茶材料中筛选出36份高氨基酸材料和1份高茶氨酸材料。研究茶树功能性成分,筛选功能性强的茶树种质资源,对于功能性茶树育种具有重要意义。

主成分分析能较好地解释群体方差的主要来源,获得解释方差的重要性状并简化研究性状,以利于更好地研究群体,是一种比较成熟的综合评价方法[17],在种质资源评价和筛选等方面[18-20]广泛应用。利用主成分分析探索功能性茶树种质资源的评价指标,构建综合评价模型,可更加科学地筛选功能优良的茶树种质资源。已有文献[15,21]对功能性茶树种质资源的筛选仅侧重于单一的功能性成分,未从整体对主要功能性成分进行综合评价。因此,本研究以30个适制乌龙茶的茶树品种(品系)为材料,在同一生境下进行综合分析,对其功能性成分含量和遗传多样性进行了比较和分析,通过相关性分析、主成分分析和聚类分析等方法筛选出代表性评价指标及功能优良的茶树种质资源,并建立了综合评价模型,以期为茶树品质功能评价及后续功能性茶树培育奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验在武夷山市旗山科技工业园区茶树种质资源圃(东经117°59′、北纬27°43′,海拔210 m)内进行,年均温20 ℃,无霜期270 d,年均降水量1 927 mm,光照充足,雨量充沛,属于中亚热带季风气候[22]。试验材料为资源圃收集的30份适制乌龙茶的茶树材料,各材料处于同一生境、管理措施一致。其中‘梅占’(‘Meizhan’)、‘水仙’(‘Shuixian’)、‘悦茗香’(‘Yuemingxiang’)、‘黄观音’(‘Huangguanyin’)、‘本山’(‘Benshan’)、‘毛蟹’(‘Maoxie’)、‘黄玫瑰’(‘Huangmeigui’)、‘瑞香’(‘Ruixiang’)、‘金观音’(‘Jinguanyin’)、‘丹桂’(‘Dangui’)、‘铁观音’(‘Tieguanyin’)、‘八仙’(‘Baxian’)、‘紫牡丹’(‘Zimudan’)、‘金牡丹’(‘Jinmudan’)、‘黄旦’(‘Huangdan’)和‘春兰’(‘Chunlan’)是国家级乌龙茶品种;‘肉桂’(‘Rougui’)、‘佛手’(‘Foshou’)、‘奇兰’(‘Qilan’)、‘紫玫瑰’(‘Zimeigui’)、‘白牡丹’(‘Baimudan’)、‘九龙袍’(‘Jiulongpao’)和‘大红袍’(‘Dahongpao’)是省级乌龙茶品种;‘天福星1号’(‘Tianfuxing 1’)、‘金福星1号’(‘Jinfuxing 1’)和‘金福星2号’(‘Jinfuxing 2’)是农业农村部审定的乌龙茶品种;‘金福星3号’(‘Jinfuxing 3’)、‘金福星4号’(‘Jinfuxing 4’)、‘桂福星1号’(‘Guifuxing 1’)和‘桂福星2号’(‘Guifuxing 2’)是武夷星茶业有限公司与福建农林大学共同培育的乌龙茶新品种(系)。于2021年4月初,每个品种(品系)随机采集无病虫害的一芽二叶200 g,液氮固样,使用pllot3-6L真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)干燥30 h。干燥后使用Tissuelyser-96多样品组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)进行研磨,装入塑封袋置于-20 ℃冰箱中保存、备用。

1.2 方法

参照GB/T 8314—2013中的方法检测游离氨基酸含量;参照GB/T 8313—2008中的方法检测茶多酚含量;参照GB/T 8305—2013中的方法检测水浸出物含量;参照GB/T 8313—2008中的高效液相色谱法检测儿茶素和生物碱各组分含量,儿茶素组分包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表儿茶素(EC)和没食子酸(GA),生物碱组分包括咖啡碱、可可碱和茶叶碱。每个材料设置3次重复,每个成分重复测定3次,结果取平均值。

1.3 数据处理和分析

使用EXCEL 2010软件对原始数据进行整理和统计;参考文献[23]中的方法计算Shannon-Wiener指数(H′),用于表示遗传多样性;采用变异系数(CV)表示各功能性成分含量在材料间的差异性。使用SPSS 17.0软件对数据进行Pearson相关性分析,根据欧氏距离对供试材料进行聚类分析,采用Kaiser标准化的正交旋转法进行主成分分析,按照特征值大于等于1的标准提取主成分[24];基于相关性分析和多样性分析结果,参考文献[25]中的方法筛选代表性指标,从各主成分中特征向量绝对值较大的指标中选相关性不显著、显著负相关或极显著负相关且Shannon-Wiener指数较大的指标;若指标间均显著或极显著正相关,选Shannon-Wiener指数最大的指标。以各功能性成分含量的特征向量为依据确定各主成分的得分系数并构建综合模型,最后根据综合得分对材料进行排序和分级[26];使用SPSS 17.0软件,采用最小显著差异法(LSD)对上述分级结果进行多重比较。

2 结果和分析

2.1 茶树功能性成分的遗传多样性分析

30份茶树材料功能性成分含量及遗传多样性的比较见表1。结果显示:30份茶树材料的游离氨基酸、茶多酚、水浸出物、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表儿茶素(EC)、没食子酸(GA)、咖啡碱、可可碱和茶叶碱含量分别为29.11～49.94 mg·g-1、143.44～249.79 mg·g-1、44.63%～55.74%、81.92～132.25 mg·g-1、7.35～28.26 mg·g-1、0.04～0.18 mg·g-1、0.91～2.33 mg·g-1、8.43～41.77 mg·g-1、0.74～3.71 mg·g-1、4.40～14.42 mg·g-1、0.01～0.31 mg·g-1、34.91～50.17 mg·g-1、1.30～7.58 mg·g-1、0.06～0.54 mg·g-1,其中,‘天福星1号’的茶多酚、EGCG、ECG、可可碱和茶叶碱含量均最高,明显高于其他材料,水浸出物、GCG、EC和咖啡碱含量也较高。方差分析结果显示:供试茶树材料间各功能性成分含量的差异均达极显著水平。

表1 30份茶树材料功能性成分含量及遗传多样性的比较

结果(表1)还显示:14个成分含量的变异系数为4.98%～79.96%,变化范围较大,存在丰富的变异,其中,GA含量的变异系数最大,水浸出物含量的变异系数最小。说明供试茶树中水浸出物的改良潜力较小。

结果(表1)还显示:14个成分含量的Shannon-Wiener指数平均值为1.90,从高至低依次为EGCG含量、水浸出物含量、可可碱含量、游离氨基酸含量和EGC含量、GC含量、茶多酚含量、咖啡碱含量、ECG含量、GCG含量、GA含量、茶叶碱含量、C含量、EC含量,其中,EGCG含量的Shannon-Wiener指数最大(2.20),EC含量的Shannon-Wiener指数最小(1.68)。说明供试茶树材料的功能性成分有丰富的遗传多样性。

2.2 茶树功能性成分的相关性分析

对30份茶树材料不同功能性成分含量进行相关性分析,结果见表2。结果显示:茶树各功能性成分含量间存在不同程度相关性。其中,游离氨基酸含量与茶多酚、水浸出物、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表儿茶素(EC)含量呈极显著或显著负相关,与没食子酸(GA)含量呈显著正相关;茶多酚含量与GA含量呈显著负相关,与其他成分含量呈极显著或显著正相关;水浸出物含量与EGCG、ECG、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、没食子儿茶素(GC)、EC和生物碱(咖啡碱、可可碱和茶叶碱)含量呈极显著或显著正相关;EGCG含量与儿茶素(C)和GA含量无显著相关性,与其他成分含量呈极显著或显著正相关;ECG含量与GC、EC和生物碱含量呈极显著或显著正相关;GCG含量与表没食子儿茶素(EGC)、GA和生物碱含量呈极显著或显著正相关;C含量与EGC、EC和咖啡碱含量呈极显著或显著正相关,与GA含量呈显著负相关;EGC含量与GC和EC含量呈极显著或显著正相关,与GA含量呈极显著负相关;GC含量与EC和茶叶碱含量呈极显著负相关;EC含量与GA含量呈极显著负相关;GA含量与可可碱含量呈显著正相关;咖啡碱含量与可可碱和茶叶碱含量呈极显著正相关;可可碱含量与茶叶碱含量呈极显著正相关。

表2 30份茶树材料不同功能性成分含量间的相关系数1)

2.3 茶树功能性成分的主成分分析

对30份茶树材料各功能性成分含量进行主成分分析,结果见表3。结果显示:前4个主成分的特征值大于1,累计贡献率为70.870%,基本能够反映供试30份茶树材料品质功能的综合信息。第1主成分的贡献率为34.844%,其中,没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、可可碱、茶叶碱、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、咖啡碱和水浸出物含量特征向量的绝对值较大,均在0.5以上;第2主成分的贡献率为18.774%,其中,表儿茶素没食子酸酯(ECG)、游离氨基酸、表儿茶素(EC)、茶多酚和水浸出物含量特征向量的绝对值较大,均在0.5以上;第3主成分的贡献率为9.563%,其中,表没食子儿茶素(EGC)含量特征向量的绝对值较大,为0.921;第4主成分的贡献率为7.689%,其中,水浸出物、儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)和咖啡碱含量特征向量的绝对值较大,均在0.5以上。

表3 30份茶树材料各功能性成分含量的主成分分析结果1)

结合相关性分析和遗传多样性分析结果筛选代表性指标(水浸出物由于改良潜力较小不纳入筛选范围),第1主成分中EGCG、GCG、咖啡碱、可可碱和茶叶碱含量间均存在极显著或显著正相关,其中EGCG含量的Shannon-Wiener指数最大,选EGCG含量作为功能因子;第2主成分中游离氨基酸含量与茶多酚、ECG和EC含量呈极显著或显著负相关,其中茶多酚含量的Shannon-Wiener指数较大,选游离氨基酸和茶多酚含量作为功能因子;第3主成分中选EGC含量作为功能因子;第4主成分中GC含量与C和咖啡碱含量无显著相关性,其中咖啡碱含量的Shannon-Wiener指数较大,选GC和咖啡碱含量作为功能因子。因此,选EGCG、游离氨基酸、茶多酚、EGC、GC和咖啡碱含量6个指标作为评价茶树品质功能的代表性指标。

2.4 茶树材料的聚类分析

基于上述6个代表性指标对30份茶树材料进行聚类分析,并对各类材料代表性功能性成分含量进行比较,结果(图1和表4)显示:在欧氏距离13.5处,30份茶树材料分为4类。Ⅰ类包括‘桂福星1号’、‘白牡丹’、‘佛手’、‘水仙’、‘金福星1号’和‘丹桂’6份材料,该类材料的表没食子儿茶素(EGC)和没食子儿茶素(GC)含量的平均值最大,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量的平均值也较大,明显大于Ⅲ类和Ⅳ类。Ⅱ类仅包括‘天福星1号’1份材料,该类材料的茶多酚、EGCG和咖啡碱含量的平均值最大,GC含量的平均值也较大,明显大于Ⅲ类和Ⅳ类。Ⅲ类包括‘奇兰’、‘九龙袍’、‘金福星2号’、‘铁观音’、‘金牡丹’、‘金福星3号’、‘金观音’、‘金福星4号’、‘大红袍’、‘悦茗香’、‘黄观音’、‘肉桂’、‘瑞香’、‘紫牡丹’、‘黄旦’、‘黄玫瑰’、‘春兰’、‘紫玫瑰’、‘梅占’、‘本山’、‘八仙’和‘桂福星2号’22份材料,该类材料的游离氨基酸含量的平均值最大;Ⅳ类仅包括‘毛蟹’1份材料,该类材料除游离氨基酸和EGC含量的平均值较小外,其余4个成分含量的平均值均最小。

图1 30份茶树材料的聚类图

表4 不同类别茶树材料代表性功能性成分含量的比较

2.5 茶树材料的综合评价

将14个功能性成分含量对应主成分的特征向量除以对应主成分特征值的算术平方根得出各成分含量在各主成分中的得分系数(表5),构建以4个主成分为参数的线性组合模型,第1、第2、第3和第4主成分的模型分别为y1=-0.007x1+0.178x2+0.229x3+0.285x4+0.122x5+0.335x6-0.039x7-0.007x8+0.053x9+0.005x10+0.173x11+0.230x12+0.334x13+0.333x14,y2=-0.599x1+0.505x2+0.403x3+0.337x4+0.616x5-0.084x6+0.022x7+0.118x8+ 0.123x9+0.576x10-0.370x11-0.005x12+0.078x13+0.153x14,y3=-0.016x1+0.424x2+0.121x3+0.220x4-0.202x5+0.584x6+ 0.515x7+1.376x8+0.018x9+0.469x10-0.603x11+0.336x12-0.357x13-0.254x14,y4=0.226x1+0.467x2+0.377x3+0.292x4+ 0.286x5-0.344x6+1.357x7+0.331x8+1.160x9+0.559x10-0.134x11+0.965x12+0.448x13+0.059x14;式中,x1至x14分别为游离氨基酸、茶多酚、水浸出物、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表儿茶素(EC)、没食子酸(GA)、咖啡碱、可可碱和茶叶碱含量的标准化数值,y1至y4分别为第1、第2、第3和第4主成分的得分。

表5 30份茶树材料各功能性成分含量的得分系数

基于各主成分的累计贡献率进一步建立茶树材料的综合评价模型,用于计算综合得分(y),模型为y=(34.844y1+18.774y2+9.563y3+7.689y4)/70.870,根据此模型对30份茶树材料进行综合评价,结果见表6。结果显示:综合得分越高,茶树种质资源综合功能性越好。根据各材料综合得分可将30份茶树材料分为4个等级,一级的综合得分大于3.50,为综合功能性最好的茶树种质资源,包括‘天福星1号’、‘金福星1号’和‘水仙’3份材料;二级的综合得分为1.40～3.50,为综合功能性较好的茶树种质资源,包括‘白牡丹’、‘桂福星1号’、‘佛手’和‘丹桂’4份材料;三级的综合得分为-1.30～1.40,为综合功能性一般的茶树种质资源,包括‘肉桂’、‘金福星4号’、‘大红袍’、‘悦茗香’、‘金观音’、‘金牡丹’、‘金福星2号’、‘黄观音’、‘金福星3号’、‘铁观音’、‘八仙’、‘黄玫瑰’、‘九龙袍’、‘奇兰’、‘瑞香’和‘春兰’16份材料;四级的综合得分小于-1.30,为综合功能性较差的茶树种质资源,包括‘紫玫瑰’、‘梅占’、‘紫牡丹’、‘桂福星2号’、‘黄旦’、‘本山’和‘毛蟹’7份材料。多重比较结果显示:划分的4个等级茶树材料的综合评价指数在0.05水平上差异显著,说明划分的等级结果合理。

表6 30份茶树材料的综合评价1)

结合聚类结果,综合排名在第2至第7的材料集中分布在Ⅰ类,其中,‘金福星1号’的综合得分最高(3.88);Ⅱ类的‘天福星1号’综合得分最高(4.70);综合排名在第8至第29的材料集中分布在Ⅲ类,其中,‘肉桂’的综合得分最高(1.39);Ⅳ类的‘毛蟹’综合得分最低(-2.79)。整体而言,综合得分从高至低依次为Ⅱ类、Ⅰ类、Ⅲ类、Ⅳ类,Ⅱ类和Ⅰ类茶树材料的综合功能性较好。

3 讨论和结论

种质资源的遗传多样性是育种的基础,遗传多样性越大说明种质资源遗传基础较为广泛,对品种选育及新品种培育越有潜力[27]。Shannon-Wiener指数(H′)是评价植物遗传多样性的重要指标之一,H′值大于1表示多样性水平高;而变异系数可反映变异程度和稳定性,性状的变异频率是性状遗传多样性的数量化体现[28]。本研究中,30份茶树材料14个功能性成分含量的H′值为1.68～2.20,平均值为1.90,高于或接近重庆[29]、贵州[30]和杭州[31]茶树材料的平均值,H′值整体偏高;各成分含量的变异系数为4.98%～79.96%,平均值为28.23%,高于重庆[29]、贵州[30]和云南[32]茶树材料,低于湖南莽山[33]茶树材料。说明供试茶树材料功能性成分的遗传多样性和变异类型较为丰富,遗传基础较为广泛,具备选育优良功能性茶树种质资源的潜力。此外,30份茶树材料中有29份材料的水浸出物含量大于45.00%,说明大部分茶树的内含物丰富,具有良好的综合利用物质基础,可为新品种培育提供较为广阔的材料。值得注意的是,与部分地区相比,供试茶树材料存在主要功能性成分含量的遗传多样性大但变异系数小的情况,比如水浸出物含量的H′值较大(2.01),但其变异系数却最小(4.98%),说明茶树功能性成分的遗传多样性具有一定区域和种群间差异性[34]。

罗理勇等[35]对重庆地区主要茶树栽培品种的研究结果表明:游离氨基酸含量与茶多酚含量呈显著负相关,与表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、咖啡碱和茶叶碱含量呈极显著正相关;赵洋等[36]研究发现水浸出物含量与茶多酚含量呈正相关,高长清等[37]在研究茶树种质资源春梢的生化成分时发现,EGCG含量与表儿茶素没食子酸酯(ECG)和没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)含量间存在显著正相关。本研究中,茶多酚、水浸出物和生物碱(咖啡碱、可可碱和茶叶碱)含量与酯型儿茶素(EGCG、ECG和GCG)含量均呈极显著正相关,茶多酚与没食子酸(GA)和游离氨基酸含量分别呈显著和极显著负相关,与其余成分含量均呈显著或极显著正相关。说明茶树各成分含量间存在不同程度的相关性,彼此间相互影响。因此,从众多指标中选取有代表性的指标尤为重要。主成分分析在薄壳山核桃〔Caryaillinoinensis(Wangenh.) K. Koch〕[38]、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕[39]和枸杞(LyciumchinenseMiller)[40]品质及茶树中矿质元素分析评价[41]上均有应用,该方法能有效地对品质进行综合评价。本文中筛选出的EGCG、游离氨基酸、茶多酚、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)和咖啡碱含量可用于茶树品质功能的综合评价。

基于上述6个指标的聚类分析结果显示:在欧氏距离13.5处,30份茶树材料分为4类。与综合评价中排序结果基本吻合,进一步说明供试材料具有丰富的遗传多样性,所选指标具有一定的代表性,评价结果较准确。综合排名前7的材料为‘天福星1号’、‘金福星1号’、‘水仙’、‘白牡丹’、‘桂福星1号’、‘佛手’和‘丹桂’,综合得分大于1.40,这些材料在聚类分析中聚为Ⅰ类和Ⅱ类,茶多酚、EGCG和GC含量的平均值明显大于其他材料,咖啡碱含量的平均值也较大,可考虑作为功能优良的亲本材料。王飞权等[42]和冯花等[11]在基于茶树农艺性状、生化成分分析时发现‘白牡丹’、‘水仙’和佛手’在品质产量方面表现优良。‘天福星1号’、‘桂福星1号’和‘金福星1号’分别是从武夷名丛‘半天妖’(‘Bantianyao’)、‘武夷金桂’(‘Wuyijingui’)和‘水金龟’(‘Shuijingui’)[43-44]选育出的新品种(系),有望成为功能性新品种(系)加以推广种植。综合比较认为,Ⅰ类和Ⅱ类材料可作为选育高茶多酚、高EGCG茶树的亲本,Ⅲ类材料可作为选育高游离氨基酸茶树的亲本,Ⅳ类材料可作为选育低咖啡碱茶树的亲本,可在今后茶树育种、功能性茶产品的开发中加以利用,发挥其特有的价值。由于茶树种植地分布广泛,同一种质资源因其生态环境条件不同可能存在一定差异,因此,在选择育种亲本时应该根据茶树种植地气候进行种质资源的评价。

综上所述,供试茶树材料功能性成分的遗传多样性丰富,挖掘利用潜力大;以‘天福星1号’、‘金福星1号’、‘水仙’、‘白牡丹’、‘桂福星1号’、‘佛手’和‘丹桂’的综合功能性较好;EGCG、游离氨基酸、茶多酚、EGC、GC和咖啡碱含量可作为初步评价功能性茶树种质资源的指标。本研究仅针对14个功能性成分进行研究,下一步将扩大功能性评价指标,如抗性和适应性等相关指标,更系统地建立功能性茶树种质资源综合评价体系。