血清TLR4和VEGFA表达对糖尿病视网膜病变的临床诊断及预后价值评估

闫秀丽,王 钦,陆相庆

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)、血管内皮生长因子A(VEGFA)在糖尿病视网膜病变(DR)患者血清中的表达情况及临床意义。

方法:选取2021-01/2022-01本院收治的183例2型糖尿病(T2DM)患者为研究对象,分为非糖尿病视网膜病变(NDR)组(54例),增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)组(68例)和非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)组(61例)。同期按照年龄、性别分层随机选择70例于本院进行健康体检志愿者作为对照组。出院后随访1a,根据DR患者是否发生视力残疾,分为预后不良组(40例)与预后良好组(89例)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TLR4、VEGFA水平;通过Logistic回归分析DR发生的影响因素;利用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清TLR4、VEGFA水平诊断DR及预测预后的临床价值。

结果:对照组、NDR组、PDR组和NPDR组间TLR4、VEGFA水平比较均具有差异(F=935.753、516.936,均P<0.05),各组两两比较均具有差异(P<0.05)。预后不良组患者血清中TLR4、VEGFA表达水平均高于预后良好组(P<0.01)。Logistic回归分析结果显示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR发生的危险因素(P<0.05);ROC结果显示,血清TLR4、VEGFA水平及二者联合预测DR的AUC分别为0.869、0.862、0.931,血清TLR4、VEGFA水平及二者联合预测DR患者视力残疾的AUC分别为0.864、0.863、0.938。

结论:DR患者血清中TLR4、VEGFA表达均上调,二者联合检测可作为评估DR发生及预后不良的潜在指标。

•KEYWORDS：diabetic retinopathy; Toll-like receptor 4 (TLR4); vascular endothelial growth factor A (VEGFA)

0 引言

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种伴多种并发症的代谢综合征,近几十年来在世界范围内的患病率呈上升趋势[1]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是DM的主要并发症,可导致视网膜血管异常和严重的视力损害[2-3]。DR发病的确切分子机制尚不清楚,治疗选择也有限[4]。因此,迫切需要发现新的治疗靶点和发展早期检测方法来治疗和预防DR。血清Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)是Toll样受体家族(toll-like receptor,TLR)蛋白的一员,是促炎反应的主要参与者[5]。研究发现TLR4与2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)患者微血管并发症的发生、发展有着密切的联系[6]。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是一种血管生成的主要激活剂,被认为通过诱导新生血管和增加视网膜血管的通透性来发挥重要作用[7]。两种因子均与DR相关,但二者对DR的诊断及预后价值尚不明确。基于此,本研究旨在通过检测TLR4、VEGFA在DR患者中的表达情况,分析TLR4、VEGFA与DR发展及预后预测的作用,旨在为DR的早期预防和治疗提供参考依据。

1 对象和方法

1.1对象选取2021-01/2022-01本院收治的183例T2DM患者为研究对象,根据有无DR分为DR组(129例)和非糖尿病视网膜病变(NDR)组(54例),根据DR的国际临床分类将DR患者分为增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)组(68例)和非增殖性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)组(61例)。同期按照年龄、性别分层随机选择70例于本院进行健康体检志愿者作为对照组。纳入标准:(1)符合T2DM诊断标准[8];(2)使用光学相干断层扫描和眼底荧光血管造影检查T2DM患者,诊断是否存在DR[9];(3)患者均为双眼发病。排除标准:(1)孕期、哺乳期或两者兼而有之的非糖尿病原因导致的视力丧失;(2)诊断为癌症、免疫系统疾病;(3)合并其他眼部疾病者,如视网膜血管阻塞、动脉粥样硬化、高血压、血液病或糖尿病眼底病变,视网膜脱离、视网膜肿瘤或其他相关疾病;(4)使用抗代谢物或免疫抑制剂;(5)临床资料不完整者。本研究经我院伦理委员会批准,并向入组受试者告知研究情况并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集从每位同意的患者身上采集大约10mL空腹静脉血,放入血清分离管。血液样品凝固30min,然后在固定角度离心机中以1300×g离心15min。然后分离血清,并立即在-80℃保存,以待进一步研究。

1.2.2酶联免疫吸附法检测血清中TLR4和VEGFA水平采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)根据制造商的说明,使用TLR4(货号EK-H10214,EK-Bioscience)和VEGFA检测试剂盒(货号KIT11066,Sino Biological Inc.)测定TLR4、VEGFA的水平。

1.2.3临床资料收集及生化指标测定从我院病历管理系统中收集患者的姓名、性别、年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、住院次数、糖尿病病程、糖尿病家族史、身高、体质量、收缩压和舒张压(入院当天,充分休息后,由我科护士用电子血压计测量血压)等资料。采用全自动生化分析仪测定血清糖脂代谢指标,包括空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,采用放射免疫法测定空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)水平。

1.2.4预后随访DR患者均进行规范化治疗,治疗方法参考《我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南(2014年)》[9]。出院后均进行随访,为期1a,用标准对数远视力表根据患者是否发生视力残疾[10],分为预后不良组(40例)与预后良好组(89例)。

2 结果

2.1一般资料比较各组年龄、性别、BMI、收缩压、舒张压、LDL-C、TC水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,NDR组、NPDR组、PDR组血清中HbA1c、FBG、FINS、TG水平均升高,HDL-C水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NDR组比较,NPDR组病程、HbA1c、TG水平均升高,PDR组病程、FINS水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 一般资料比较

2.2各组血清中TLR4和VEGFA水平比较四组间TLR4、VEGFA水平比较,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,NDR组、PDR组、NPDR组患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05);与NDR组比较,PDR组和NPDR组患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05);与NPDR组比较,PDR组患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05),见表2。

表2 各组血清中TLR4和VEGFA表达水平

2.3影响DR发生的危险因素分析以是否发生DR为因变量,以TLR4、VEGFA、病程、HbA1c、FINS、TG为自变量,进行Logistic回归分析,结果显示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR发生的危险因素(P<0.05),见表3。

表3 多因素Logistic回归分析

2.4 ROC曲线分析血清中TLR4和VEGFA预测DR发生的诊断价值以发生DR患者(NPDR组和PDR组)和未发生DR患者(NDR组)的TLR4、VEGFA数据作ROC曲线。ROC结果显示,血清TLR4、VEGFA水平预测DR发生的AUC分别为0.869(95%CI:0.812～0.915)、0.862(95%CI:0.909～0.980),最佳截断值分别为:16.82ng/L、92.32pg/mL,对应的敏感度分别为83.72%、82.95%,特异度分别为79.63%、88.89%,血清TLR4、VEGFA水平联合预测的AUC为0.931(95%CI:0.884～0.963),较血清中TLR4、VEGFA单独检测的AUC升高,敏感度为82.17%,特异度为94.44%,见图1。

图1 血清TLR4及VEGFA水平预测DR发生的ROC曲线。

2.5不同预后患者血清中TLR4和VEGFA水平比较预后不良组患者血清中TLR4、VEGFA表达水平均高于预后良好组,差异均有统计学意义(P<0.01),见表4。

表4 两组血清中TLR4和VEGFA表达水平

2.6 ROC曲线分析血清中TLR4及VEGFA预测DR患者视力残疾的预测价值ROC结果显示,血清TLR4、VEGFA水平预测DR患者视力残疾的AUC分别为0.864(95%CI:0.793～0.918)、0.863(95%CI:0.792～0.917),最佳截断值分别为25.21ng/L、136.84pg/mL,对应的敏感度分别为85.00%、80.00%,特异度分别为83.15%、89.89%,血清TLR4、VEGFA水平联合预测的AUC为0.938(95%CI:0.882～0.973),较血清中TLR4、VEGFA单独检测的AUC升高,敏感度为80.00%,特异度为97.75%,见图2。

图2 血清TLR4及VEGFA水平预测DR患者视力残疾的ROC曲线。

3 结论

DR是糖尿病最常见的微血管并发症,也是造成失明的主要原因[11-12]。在NPDR的早期,慢性高血糖会损害供应视网膜的微血管,导致缺血、血管渗漏,以及由糖尿病黄斑水肿引起的中心视力丧失[13]。随着疾病进展为PDR,会出现与视网膜继发性新生血管相关的视力丧失,以及随后的出血、视网膜脱离。先前的研究表明,DR的进展和视力丧失会损害患者的生活质量。如果没有适当的干预,大约一半的高危PDR患者会在诊断后5a内因糖尿病性黄斑水肿、玻璃体出血、视网膜脱离而出现视力障碍[14]。因此,早期发现和治疗对于延缓DR的进展、避免视力丧失和减轻晚期疾病负担至关重要。

本研究结果显示,健康人群、NDR组、NPDR组、PDR组血清中HbA1c、FBG、FINS、TG、HDL-C存在显著差异,提示血糖、血脂代谢异常在DR发生、发展中发挥重要作用,可导致病情加重。

VEGF又称血管通透性因子,是一种二聚体糖蛋白,其在脊椎动物视网膜发育过程中具有促进生长代谢级联反应和血管生成的作用[15]。此前,有研究报道下调VEGFA的表达,可用于干预DM引起的视网膜微血管的炎性损伤[16]。本研究中DR患者血清中VEGFA水平显著高于NDR患者以及健康人群,随着DR患者预后不良的发生,VEGFA水平逐渐升高,提示VEGFA可能对DR的发生、进展具有促进作用,可以作为预测DR患者预后不良的潜在血清指标。这与姜富国等[17]报道一致。推测其作用机制可能由于慢性高血糖环境可导致体内蛋白质的非酶性糖基化,导致基底膜增厚,甚至引起血管闭塞阻碍氧气扩散,引起视网膜缺氧,供氧减少和活性氧合成增加可诱导VEGFA的表达,VEGFA介导内皮细胞紧密连接形成和血管舒张的中断,增加血神经屏障的通透性,从而参与DR的发展[18-19]。血脂升高通过非酶糖基化多元醇途径引起组织过氧化,导致血管壁损伤和内皮功能障碍。引起血流动力学改变,视网膜组织缺氧,随之发生微循环障碍,导致动脉粥样硬化、眼底出血等一系列微血管病变,最终形成微血栓,破坏视网膜屏障,导致DR的发生[20]。ROC结果显示,血清中VEGFA水平预测DR发生及视力残疾的AUC分别为0.862、0.863。提示VEGFA水平可在一定程度评估DR发生及预后不良,对尽早诊断DR及改善患者预后提供重要参考依据。

TLR是一个模式识别受体家族,负责炎症和免疫反应的启动,可以识别内源性和外源性配体,并与体内各种生理和病理途径相关[21]。虽然DR的详细病理生理机制尚不清楚,但越来越多的数据表明,TLR4在DR的发展中起着至关重要的作用[22]。本研究中DR患者血清中TLR4水平高于健康人群,随着PDR的发生水平逐渐升高,表明TLR4是DR发展过程中的一种重要细胞因子。推测其可能的潜在作用机制为高血糖会促使机体炎症反应程度加重,导致TLR4分泌增加[22],TLR4信号通路的激活导致下游促炎细胞因子和黏附分子增加,参与炎症反应[23]的发生,引起血管外渗或血管通透性增加、血管梗阻、新生血管变性和病理改变等病理改变,从而导致DR的发生发展[24-25]。Logistic回归分析结果显示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR发生的危险因素,分析原因是HbA1c作为评估血糖控制情况的重要指标,随着病程延长,患者血糖控制不佳,导致DR风险增加。此外也提示临床表现为TLR4、VEGFA高表达的患者,应及时针对制定方案治疗,延缓疾病进展;ROC结果显示,血清TLR4水平预测DR患者视力残疾的AUC为0.864,二者联合预测的AUC为0.938。提示TLR4、VEGFA联合评估DR发生及预后不良的临床价值优于单一指标。

综上所述,在DR患者血清中TLR4、VEGFA水平均显著上调,二者均为DR发生的危险因素,联合检测TLR4、VEGFA血清水平可预测DR及预后不良的发生,具有重要的临床意义。但目前本研究存在局限性,样本量相对较小,还需要在更大的样本中进一步验证。