超声评估糖尿病性胃轻瘫大鼠胃动力

韩 镍,李冠恒,陆玲玲,夏佳靖,金 琳*

(1.上海中医药大学附属光华医院超声科,上海 200052;2.上海体育学院运动健康学院,上海 200438)

糖尿病性胃轻瘫(diabetic gastroparesis, DGP)是以非机械梗阻胃延迟排空为主要特征的综合征[1],早期常伴嗳气、恶心、呕吐及上腹痛等症状,严重影响患者生活质量,且近年来发病率迅速增长。另一方面,由于糖尿病引发胃动力障碍的机制较为复杂,导致成模率较低,目前尚无获得广泛认可的DGP动物模型[2]。超声可用于评估胃动力,但相关动物模型研究较少,且缺乏统一标准。本研究通过小剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)联合不规律高脂高糖饮食法构建大鼠DGP模型,观察超声用于评估其胃动力的价值。

1 资料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性6周龄SD大鼠26只[动物许可证号:SCXK(沪)2022-0004],体质量(200±20)g;饲养条件:温度(22±2)℃,相对湿度40%～60%,24 h自由饮水。本实验经机构伦理委员会批准(批准号:20221130)。

1.2 主要仪器及试剂 罗氏血糖仪;佳能Aplio i800超声诊断仪,配备18 MHz线阵探头、速溶胃肠超声助显剂;成都泰盟HV1403多通道数据采集和分析系统。STZ、卡巴胆碱(carbachol, CCh)、戊巴比妥钠(美国Sigma);柠檬酸钠缓冲液(北京索莱宝科技有限公司);磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)(苏州君欣生物科技有限公司);克-亨液(Krebs-Hensleit's solution)(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

1.3 建立大鼠DGP模型 将接受普通饲料(含碳水化合物50%、脂肪10%、蛋白质20%)适应性饲养1周的26只大鼠随机分为模型组(n=18)和对照组(n=8),分别以高脂高糖饲料(基础维持饲料68.8%、猪油10%、蔗糖20%、胆固醇1%、胆酸钠0.2%)和普通饲料饲养1周。于实验第3周始对模型组大鼠经腹腔注射1% STZ溶液(以pH 值为4.4的0.1 mol/L柠檬酸缓冲溶液配制)20 mg/kg体质量,72 h后经尾静脉取血,测定非空腹血糖,以>16.7 mmol/L为建模成功[3];否则再经腹腔注射STZ溶液25 mg/kg体质量,72 h后测定非空腹血糖,若仍未建模成功继续重复上述干预,直至建模成功或死亡。对照组大鼠经腹腔注射等量柠檬酸缓冲溶液。建模期间对模型组大鼠均以不规律高脂高糖饮食法饲养,单数日上午进食、双数日下午进食;对照组大鼠以规律普通饲养法饲养。每周记录大鼠体质量和非空腹血糖,共持续8周。

1.4 测试口服葡萄糖糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT) 成功建模后对2组大鼠停饲但不禁饮12～14 h,之后以50%葡萄糖溶液(2 ml/kg体质量)灌胃,分别于灌胃后0(即刻)、30、60、90及120 min经尾静脉取血,检测血糖值。

1.5 超声检查 检查前对2组大鼠停饲8 h。以100℃饮用水冲泡50 g胃肠超声助显剂至约250 ml,冷却至37℃,以强饲法予大鼠5 ml助显剂实验餐。腹部检查区域备皮后,将大鼠置于鼠套中,以半仰卧位保定于可塑性软垫中,尽量使其处于较自然状态,于鼠套中央开口以暴露腹部。将探头置于左肋弓下,观察胃窦、胃体和胃底区域,以超声全胃圆柱体法(ultrasonic whole stomach cylinder method, UWSCM)公式计算实验餐后0(即刻)、30及60 min全胃腔容积[4];以左肝、肠系膜上静脉及腹主动脉为定位标志,获取胃窦短轴切面,计算实验餐后0(即刻)、30及60 min胃窦面积[5];分别按照以下公式计算胃排空率(gastric emptying rate, GER)、胃窦收缩频率(antrum contraction frequency, ACF)、胃窦收缩幅度(antrum contraction amplitude, ACA)及胃窦动力指数(motility index, MI):胃窦GER=(1-实验餐后不同时间点胃窦面积/实验餐后即刻胃窦面积)×100%,全胃腔GER=(1-实验餐后不同时间点全胃腔容积/实验餐后即刻全胃腔容积)×100%, ACF=进食实验餐后前9 min内每3 min胃窦收缩次数的平均值, ACA=[胃窦最大舒张面积(Areamax)-胃窦最小收缩面积(Areamin)]/胃窦最大舒张面积×100%, MI=ACA×ACF。

1.6 离体胃窦肌条实验 以过量戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠,取胃窦近幽门部位组织并制成10 mm×3 mm平滑肌条,置于4℃ PBS中备用;将肌条一端固定于恒温浴槽底部、另一端与拉力传感器感应头相连,使肌条处于完全松弛状态并垂直浸没于37℃恒温浴槽中;加入10 ml克-亨氏液,持续混合后通入95% O2和5% CO2;牵拉肌条至最适张力[(1.2±0.1)g],平衡约30 min后向浴槽滴加0.5 mol/L CCh,以多通道数据采集和分析系统记录张力;记录肌条最大收缩力,即最大刺激后张力与刺激前张力之差。

1.7 病理检查 对胃窦组织行HE染色,之后于光镜下观察胃窦黏膜层及肌层细胞形态。

1.8 统计学分析 采用SPSS 27.0统计分析软件。以±s表示计量资料,行两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

模型组首次注射后8只建模成功,其余10只未能成功;第二次注射后4只建模成功、4只未成功;第三次注射后2只建模成功、2只死亡。

2.1 体质量、血糖及OGTT 第6～8周,模型组大鼠体质量均明显低于对照组(P均<0.05,图1A)。第3周始模型组大鼠非空腹血糖显著升高(P均<0.05,图1B),各时间点糖耐量水平均显著高于对照组(P均<0.05,图1C)。

图1 大鼠体质量、血糖及糖耐量变化曲线 A.体质量; B.非空腹血糖; C.糖耐量 (*:P<0.01)

2.2 超声 相比对照组,模型组大鼠实验餐后30、60 min GER显著降低(表1);模型组Areamin大于、ACA和MI均小于对照组(P均<0.001,表2);见图2。

表1 模型组与对照组大鼠实验餐后GER比较(%)

表2 模型组与对照组大鼠胃窦动力相关指标比较

图2 超声声像图示大鼠实验餐后胃排空表现 A.全胃腔容积(箭); B.胃窦面积(箭)

2.3 离体胃窦平滑肌条实验 模型组大鼠离体胃窦平滑肌肌条最大收缩力[(0.58±0.32)g]小于对照组[(1.12±0.24)g](P<0.001,图3)。

图3 滴加0.5 mol/L CCh后大鼠离体平滑肌条实验 A.收缩反应图; B.最大收缩力柱状图

2.4 病理学所见 模型组大鼠胃窦黏膜层胃小凹沟纹不均匀,部分上皮细胞脱落,主细胞及壁细胞减少(图4A);对照组大鼠胃窦黏膜结构层次清晰,腺体分布规则,排列致密、整齐(图4B)。模型组大鼠胃窦平滑肌细胞变小,可见空泡样改变,细胞核不规则、核膜皱缩明显(图4C);对照组大鼠胃窦平滑肌细胞多呈梭形,细胞核规则,呈长椭圆形,核膜相对平滑,褶皱少而浅(图4D)。

图4 胃窦组织病理图 A、B.模型组(A)及对照组(B)大鼠胃窦黏膜层(HE,×200); C、D.模型组(C)及对照组(D)大鼠胃窦肌层(HE,×400)

3 讨论

理想的动物模型对探索糖尿病DGP病理生理机制及治疗方法十分重要。糖尿病引起胃排空障碍不仅与胃排空延迟有关,还与胃排空加速有关[6];但在建立DGP动物模型过程中,胃延迟排空并非必然现象,导致成模率较低。

目前常见DGP动物模型主要分为糖尿病自然模型和糖尿病非自然模型,后者指在糖尿病基础上联合不规律高脂高糖饮食所建立的DGP模型。本研究通过小剂量多次注射STZ联合不规律高脂高糖饮食成功建立了大鼠DGP模型。相比单次大剂量注射STZ,小剂量多次注射可使血糖水平逐步上升,逐渐破坏大鼠胰岛β细胞,降低其酮症死亡率,且更接近于人类DGP发生发展过程[7-8];联合不规律高脂高糖饮食可进一步缩短后续胃轻瘫发展时间,以于较短时间内成模,且所获模型较为稳定[2,9]。

核素检查为诊断胃排空延迟的金标准,但费用较高、难以推广。根据动物症状可评估DGP大鼠建模成功与否[10],但受观察者主观影响较大,且胃排空减缓程度与症状严重程度并非呈线性关系,不足以准确判断[1]。亦可采用终末性测试检测胃排空情况评估建模成功与否,该方法经济、简便、对设备要求低,但检测后动物无法继续存活,不支持重复测量。超声为非终末性检查方法,不仅可实时评价GER和胃动力功能[11],且不影响动物存活;予大鼠口服超声助显剂后,胃底出现容受性舒张,助显剂在胃底、胃体部逐步充填并向胃窦部推进,期间全胃腔容积及胃窦面积逐步减小,可利用超声动态观察胃收缩、蠕动及排空全过程,进而评价胃动力情况[11-14]。WU等[5,15]以胃窦单平面测量法评估DGP大鼠胃排空。本研究在其基础上进一步评估全胃腔容积及相关胃动力参数,结果显示模型组大鼠GER显著下降,符合DGP特征;其胃窦收缩功能和胃窦动力指数明显受损而胃窦舒张功能和收缩频率未见明显变化,原因可能与DGP病程发展有关,或与不同部位其病理损伤类型不同有关。同时,本研究离体胃窦平滑肌条实验结果显示模型组大鼠胃平滑肌收缩力显著下降,与超声表现一致,符合DGP病理学表现。

综上所述,超声可用于评估DGP大鼠模型胃动力。受气体干扰,本研究超声显示大鼠局部胃壁与助显剂分界面稍欠清晰,可能对测量结果造成影响,有待后续加以改进。