污水中红霉素抗性菌的特性

韩冰, 周丽鹏, 姚文利, 徐佳婷, 董莉莉, 孙世梅*

(1.吉林建筑大学应急科学与工程学院, 长春 130118; 2.吉林建筑大学市政与环境工程学院, 长春 130118)

随着农业技术、医疗技术的日益进步,以及人口数量的递增,开发和使用了多种抗生素保障了人类的健康和生命的安全[1-2]。因每种抗生素的结构不同、其治疗作用、治愈机理差也存在着一定差别,进入生态环境中未完全代谢的产物诱导、传播多种类型的抗性基因,致使土著微生物的获得多重抗生素抗性而出现变性,造成环境污染,危害生物的正常生命活动和健康[3-4]。随着污水处理技术和分子生物学技术迅猛发展,国内外学者开展抗生素、抗性基因的残留、迁移、转化等生态安全风险评估的研究[5]。金明兰等[6]研究结果表明污水处理厂中抗生素和抗性菌的残留量较高,存在着潜在风险。国外学者研究表明某些抗生素在动物体内不能被吸收的超过70%,以母体形式排到生态环境中,严重地威胁生态环境和人类健康[7]。如果抗性基因整合到致病菌体内,成功表达抗生素耐药性导致失去治疗的作用,并且严重地威胁人类健康[8]。研究表明,因抗生素抗性传播,美国每年有200多万人致病,全球每年约有70万人致死[9]。由此推算,通过食物链途径直接威胁人类健康,30年后全球每年将超过1 000万人致死[10]。因此,开展抗生素抗性菌株所携带的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs),探明其对多重抗生素抗性,有效抑制ARGs的潜在威胁具有非常重要作用。

红霉素是抗菌作用大、多组分、大环内酯类抗生素,结构十分稳定,难降解,易积聚,抑制生物生长[11]。

1 材料与方法

1.1 试剂

1.2 样品采集和培养基的制备

长春市北郊污水处理厂位于伊通河下游,宽城区团山街北环城路1065号,采用改良型A2O(生物脱氮除磷)工艺,日处理量39万t。在2019年 5—10月,使用聚丙烯采集瓶无菌采集进水、曝气沉砂池出水、一级出水、中间沉淀池出水、二级出水和二沉池出水,各单元每次采集10 L样品,每月处理3个/次,于4 ℃存放,尽快检测。

1.3 抗生素含量检测

将2 mL样品移入试剂瓶中,在室温条件下放置20 min,10 000 r/min离心5 min,将上清液1 mL先经过滤、调整酸碱度后萃取、活化、干燥,分装到专用的试剂瓶,定容密封待测。具体操作参照文献[13]的方法,使用高效液相色谱仪进行抗生素残留量的检测、计算。

1.4 红霉素抗性菌的分离

首先将采集的10 mL污水移入灭菌的锥形瓶内,用移液枪吸入1 mL 上清液加入含有红霉素的烧瓶,经25 ℃、160 r/min震荡、培养7 ～ 8 d,无菌移取 0.5 mL培养液,接种到红霉素浓度高出1倍培养基中,再培养 8 d。按照上述方法进行重复操作后,依次稀释抗生素浓度为 120 mg/L,倒立放置30 ℃恒温箱培养。

1.5 红霉素抗性菌的耐药性检测

按照参考文献[14]的方法,采用微量液体稀释法,在含有一定浓度的红霉素培养基中进行培养至对数生长期,将培养的新鲜菌液分别投加到抗生素倍比稀释梯度的培养基中,放置在37 ℃的培养箱内12～24 h后,观察菌株生长情况,分析和计算红霉素抗性菌的耐药性。

将红霉素抗性菌株分离、培养后,开展多种抗生素的最小抑制浓度的研究,明确抗生素敏感性的临界点,探究分离菌株的抗生素抗性[15-16]。

1.6 抗性菌的抗性基因检测

1.7 数据分析

采用 SPSS 18.0 软件,将污水中 3 种抗生素、多重抗性基因的检测结果,通过 3 次平均值进行数据分析,按照统计学中P的定义进行数据分析,判定数据间存在差异显著或极显著的意义。

2 结果与分析

2.1 污水厂各单元中抗生素残留检测结果

通过6次对污水厂中红霉素残留浓度的检测结果,初步认为在5月、10月中抗生素残留相对高于6月、7月、8月、9月,其残留浓度为16.2～86.9、14.5～82.2 ng/L和7.5～62.2、7.7～72.3、7.9～66.9、8.4～73.9 ng/L,处理效率在81.4%～89.3%。分析其主要原因为抗生素的处理效果受到污水处理工艺、污水来源、温度、酸碱度及其他残留的污染物等多种因素影响,处理效率存在一定的差别[19-20]。中国学者调查分析了多年来抗生素使用量、使用种类、残留量等,认为每年约6万t抗生素位降解产物直接进入生态环境中,加剧了生态环境的危险性,对生物体造成的潜在危害也逐步增加[21]。结果如图1所示。

图1 污水处理厂各单元抗生素残留浓度检测结果Fig.1 Concentration of antibiotics in each of the sewage

2.2 各单元中红霉素抗性菌的检测结果

污水中各单元残留的红霉素抗性菌的浓度存在一定的差别,其进水、出水中残留的红霉素抗性菌的浓度分别在6.9×105～8.4×105CFU/mL和1.8×105～3.5×105CFU/mL范围。经过处理后抗性菌的浓度显著在 5月、10月期间残留的红霉素浓度较高,分析其主要原因可能是由于这一时期抗生素生产量增加、汇集污水量多,微生物长期暴露在营养物质相对丰富,残留的抗生素浓度持续增多的环境下,诱导微生物获得多种抗生素抗性基因,并进行传播[22]。结果如图2所示。

图2 红霉素抗性菌数量检测结果Fig.2 Number of EARB in the sewage

2.3 红霉素抗性菌的耐药性检测结果

表1 红霉素抗性菌多重抗性检测结果Table 1 Multiple resistance of antibiotic-resistant bacteria

2.4 分离抗性菌株的多重抗性滴度检测结果

图3 抗性菌对抗生素抑制浓度分布Fig.3 Minimum inhibitory concentration of ARB

2.5 红霉素抗性基因检测结果

抗生素经过多种方法处理后,迁移到生态环境中的量常处在较低的浓度,致使微生物长期受到影响,获得了多重抗性基因,出现对抗生素不敏感的问题[27]。微生物通过调节自身的生理、生化功能,以应对周围环境压力的变化,从而减小外界对其生长繁殖的不良影响,诱导耐药性的发生变化。在各单元抗性基因的残留为1.3 ～ 9.5 lg(copies/L),5～10月处理效率分别为74.7%、81.2%、79.3%、77.4%、80.8%、76.5%。污水处理系统对抗生素的去除效果十分显著。在丰水期红霉素的抗性基因的检出率高于枯水期。面对环境中残留的不同类型抗生素,微生物通过产生不同的应对机制以提高自身的生存能力,因而进一步诱导了携带多重抗性基因的超级微生物,潜在危害亟待彻底消除[28]。金明兰通过污水处理厂中抗性基因检测结果表明红霉素基因中ermB 的绝对丰度最高,且携带多种抗性基因[29]。结果如表2和图4所示。

表2 抗性基因的去除效率检出结果Table 2 Efficiency of elimination of ARGs

2.6 红霉素抗性菌株的基因检测结果

表3 抗性菌未能检出基因的分布情况Table 3 Distribution of ERB with no ARGs detected

表4 红霉素抗性菌多重抗生素抗性基因检测结果Table 4 Multiple antibiotic resistance genetic testing results of erythromycin resistant bacteria

3 结论

通过对北方城市污水中红霉素浓度、抗生素抗性基因、抗性菌的检测,分析抗性菌的生物特性,阐明污水中残留的红霉素抗性菌产生多重抗性的机理,得到以下结论。

(1)目前污水处理处理技术对红霉素去除效率需要进一步提升,多重抗性菌对抗生素的抗性高于双重抗性菌、单一抗性菌。

(2)在分离的红霉素抗性菌株中,55%的菌株含有双重、多重抗性,表明污水处理系统中残留多种抗生素,微生物在长期受到抗生素压力下,获得多重抗性,对生态环境威胁巨大,亟待需要处理。

(3)在5月和10月,红霉素单一抗性菌、红霉素+磺胺双重抗性菌、三重抗性菌未检出ARGs的菌株数量高于6月、7月、8月、9月,需要探寻抗性菌、抗性基因及抗生素抗性之间的相关性。