LC-SIM-Orbitraq测定无土栽培水芹不同器官中有机酸含量

刘杰 刘吉祥 常雅军 陈婷 刘晓静 孙林鹤 姚东瑞

摘    要：以水面無土栽培水芹品种金陵1号为材料，通过液相色谱串联电喷雾质谱法（LC-SIM-Orbitraq）测定不同器官中的有机酸种类和含量。经过色谱条件的优化，25种有机酸得到较好的分离，在1×10-3～10 μg·mL-1的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.991 0～0.999 9之间；在0.5、5、20 μg·mL-1的添加质量浓度下，加标回收率在50.39%～125.32%之间；样品稳定性较好，日内稳定性在0.28%～3.99%之间，日间稳定性在0.41%～6.63%之间。结果表明，金陵1号水芹不同器官中有机酸以草酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、奎尼酸和莽草酸为主，其中，根中草酸含量（w）最高，达（32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1，这可能是水芹环境适应性强的主要原因之一；而茎、叶中苹果酸、琥珀酸和柠檬酸含量较高，说明茎、叶口感风味更佳；此外，奎尼酸和莽草酸在茎、叶中含量相对较高，可将水芹用于奎尼酸和莽草酸的提取或功能保健食品的开发，具有较大的资源化利用潜力。

关键词：水芹；无土栽培；液相色谱串联电喷雾质谱法（LC-SIM-Orbitraq）；有机酸；含量

中图分类号：S636.9 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）09-080-07

Determination of organic acids in different organs of soilless cultivated Oenanthe javanica by LC-SIM-Orbitraq

LIU Jie1， LIU Jixiang2， CHANG Yajun2， CHEN Ting1， LIU Xiaojing2， SUN Linhe2， YAO Dongrui2

（1. Nanjing Wondux Environmental Protection Technology Co.， Ltd.， Nanjing 211122， Jiangsu， China; 2. Jiangsu Engineering Research Center of Aquatic Plant Resources and Water Environment Remediation/Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences （Nanjing Botanical Garden Mem. Sun Yat-sen）， Nanjing 210014， Jiangsu， China）

Abstract： The species and content of organic acids in different organs of soilless cultivated water dropwort jinling No. 1 were determined by liquid chromatography single ion monitor orbitraq （LC-SIM-Orbitraq）. After the optimization of chromatographic conditions， 25 organic acids were well separated， and the linear relationship was good within the mass concentration range of 1×10-3-10 μg·mL-1， and the correlation coefficient was between 0.991 0 and 0.999 9. At the added concentration of 0.5， 5， and 20 μg·mL-1， the recovery rates of add standard were in the range of 50.39%-125.32%. The samples have a superior stability，the intra-day stability ranged from 0.28% to 3.99% and the inter day stability ranged from 0.41% to 6.63%. The results show that the major parts of organic acids in water dropwort jinling No. 1 are oxalic acid， succinic acid， malic acid， shikimic acid， citric acid and D-（-）-quinic acid. The oxalic acid in the root was the highest， reaching （32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1， which may be one of the main reasons for the strong environmental adaptability of water dropwort. The proportions of malic acid，succinic acid and citric acid in stems and leaves were higher than roots， indicating that stems and leaves had better taste and flavor. Moreover，the contents of D-（-）-quinic acid and shikimic acid in stems and leaves is higher than roots. Therefore， water dropwort can be used for D-（-）-quinic acid and shikimic acid extraction or functional health food development， and has great potential for resource utilization.

Key words： Soilless cultivated water dropwort; Liquid chromatography single ion monitor orbitraq （LC-SIM-Orbitraq）; Organic acids; Content

水芹[Oenanthe javanica（Bl.）DC.]，又名野芹、水英、楚葵等，为伞形科宿根性多年水生草本植物[1]。水芹是广泛分布于我国各地的传统特色蔬菜之一，以其鲜嫩的茎段和叶片为食，水芹口感清香，风味独特，富含碳水化合物、可溶性糖、氨基酸、蛋白质、维生素以及矿质元素等人体所需的营养成分[1-3]，同时还含有丰富的膳食纤维、黄酮、挥发油、苯丙素、甾醇、脂肪酸等保健成分[4-7]，具有较高的营养价值和良好的保健功能[8]。此外，水芹还是一种传统的药用植物，具有增强免疫力[9]、抗炎[10]、抗肝损伤[11]等作用，临床上具有降低血糖[12]、清热利尿[3]等医疗功效。水芹已成为一种公认的药食两用的功能保健水生蔬菜，具有极大的资源化应用潜力和开发价值[5]。目前，对水芹化学成分的研究主要集中于黄酮、总酚酸、挥发性油等药用功能成分[3，5]，而对水芹中有机酸的研究鲜见报道。

有机酸是一种广泛存在于生物体中的含有羧基的有机化合物，是水果和蔬菜中的酸味成分，会直接影响水果和蔬菜的口感、风味、营养以及加工产品的品质[13]，同时，多种有机酸均具有一定的药用功能以及特殊的功效[14]。苹果酸和柠檬酸可以调节肠道功能，促进消化吸收[15]；还会促进三羧酸循环，具有抗疲劳的功效[16]。绿原酸具有预防酒精肝、改善炎症反应、抗糖尿病、抗氧化、抗菌等多种药用功能[17-20]。此外，大量研究表明，熊果酸和齐墩果酸具有降低血脂和血糖、抗病毒、抗糖尿病等药理作用[21-26]。因此，研究水果和蔬菜中有机酸的种类和含量对其口感风味和营养价值的了解以及药理方面的应用和功能保健食品的开发具有重要意义。

不同的栽培方式会显著影响水果及蔬菜的品质和营养价值[27-28]。水芹的栽培方式根据基质可分为水面无土栽培和有土栽培，目前对水芹黄酮、挥发油、氨基酸等成分的研究主要基于土壤栽培，而对无土栽培水芹化学成分的研究较少[5，29]。近年来，大量氮、磷等营养元素进入水体，可为水生蔬菜提供生长必需的营养物质，且随着土地面积逐渐减少，利用长江流域富营养化水体无土栽培水生蔬菜，对水体中过剩营养物质的生态利用和土地资源节约具有重要意义[8]。因此，笔者的研究选取可修复富营养化水体的水芹品种金陵1号[1，30]，通过富营养化水体水面无土栽培方式，采用高效液相色谱串联电喷雾质谱法（liquid chromatography single ion monitor orbitraq，LC-SIM-Orbitraq）对金陵1号水芹不同器官中的有机酸种类和含量进行测定，为水芹的资源化利用和功能性保健食品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021年5—6月在江苏省中国科学院植物研究所进行。供试水芹品种为金陵1号，以匍匐茎种植于江苏省宿迁市渔樵专业合作社富营养化水体中。挑选长势均一、状态良好、无机械损伤的水芹植株，分别取500 g的新鲜根、茎、叶，每个部位3次重复，立即液氮速冻，粉碎备用。

丙酸、异丁酸、丁酸、草酸、乳酸、戊酸、异戊酸、丙二酸、己酸、异己酸、富马酸、琥珀酸、苯甲酸、衣康酸、戊二酸、苹果酸、水杨酸、辛酸、己二酸、酒石酸、庚二酸、莽草酸、柠檬酸、DL-异柠檬酸、奎尼酸等25种有机酸标准品购自Sigama公司，纯度均>98%；甲醇和乙腈（HPLC级）、3-硝基苯肼（3-nitrophenylhydrazine，3NPH）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC），纯度均>98%，均购自中国医药集团有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准品配制及衍生化 混标的制备：取900 μL的50%甲醇水溶液（HPLC级），装入10 mL容量瓶中，依次加入标准品10 mg，加50%甲醇水溶液定容至10 mL，涡旋混匀，再用甲醇稀释10倍后即可得标准储备溶液A。标准储备液中25种有机酸质量浓度均为100 μg·mL-1。取上述储备液按照0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10 μg·mL-1梯度稀释，装入1.5 mL的EP管中。

标准品衍生化：取适量标准品至离心管中，分别加入10 μL 0.1 mol·L-1 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和10 μL 0.2 mol·L-1 3-硝基苯肼（3NPH），40 ℃孵育反应30 min。

1.2.2 样品提取及衍生化 精确称取样本0.1 g，加入300 μL提取液（V甲醇∶V氯仿=7∶3），充分混匀；冰上提取30 min；加入200 μL H2O，混匀；4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，重复提取1次；取40 μL样品，按照标准品衍生化方法进行衍生。

1.2.3 仪器参数 采用LC-SIM-Orbitraq分析方法，对样品中有机酸进行定性定量检测，具体分析条件和分析方法如下：

色谱系统采用的是超高效液相系统（Vanquish UPLC，Thermo，Waltham，Massachusetts，USA），采用Waters BEH C18（50×2.1 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，Massachusetts，USA）液相色谱柱进行分离，进样量为2 μL，柱温为40 ℃。流动相A（0.1%甲酸，乙腈），流动相B（0.1%甲酸，水）[31]（表1）。

质谱系统采用四极杆-静电场轨道阱复合质谱仪（Q Exactive™，Thermo，Waltham，Massachusetts，USA）高分辨质谱检测系统，配有电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）和Xcalibur工作站。優化后的质谱分析条件为：鞘气40 arb，辅助气10 arb，离子喷雾电压+3000 V（-2800 V），温度350 ℃，离子传输管温度320 ℃[32]。扫描模式为Fullms-ms2；扫描方式为负离子。一级扫描范围m/z 120～1500。

将水芹样品按1.2.2方法进行处理，在1.2.3色谱条件下对样品中有机酸种类和含量进行测定，根据标准品回归方程对样品中有机酸浓度进行计算。

1.3 数据处理

使用Xcalibur 4.1（Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）在Q-Exactive上采集数据，并使用TraceFinder™ 4.1 Clinical（Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）进行处理，量化数据输出为Excel格式。所有数据图表均在WPS Office 2019及Origin 2021软件中处理、绘制，采用SPSS 26.0对试验结果进行单因素方差分析（Duancan）和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

采用外标法进行定量分析，按照1.2.3的色谱条件将不同浓度的混标溶液依次进样分析（0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10 μg·mL-1），以标准品的浓度为横坐标，以标准品的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线的回归方程，并进行相关系数分析，如表2所示。

由表2可知，这25种有机酸的标准曲线回归方程的相关系数均在0.991 0～0.999 9之间，表明有机酸组分的浓度和峰面积之间线性关系良好，可以采用该标准曲线计算金陵1号水芹中的有机酸含量。

2.2 质谱参数分析

25种有机酸的质谱参数明细如表3所示，结果显示25种有机酸标准品保留时间与样本保留时间的保留时间偏差在-0.03～0.02之间；标准品分子质量与样本分子质量的偏差在-2.43～0.41之间，表明此质谱条件下能直观测定各有机酸的含量。

2.3 稳定性和回收率检测结果

在确定的试验条件下进行检测，以3倍信噪比（S/N）计算有机酸的检出限，以10倍信噪比计算定量限，结果显示，水芹样品中25种有机酸的检出限为（5×10-4～0.005） μg·mL-1，定量限为0.001～0.01 μg·mL-1。分别对水芹样品中有机酸的日内稳定性（即样品中的有机酸在正常试验条件或适宜样品保存的条件下放置一天的稳定性）与日间稳定性（即样品中的有机酸在正常试验条件或适宜样品保存的条件下放置多天的稳定性）进行检测分析，结果显示，水芹样品中的25种有机酸的日内稳定性在0.28%～3.99%，日间稳定性在0.41%～6.63%，說明供试水芹样品稳定性较好（表4）。同时，通过添加不同质量浓度（0.5、5、20 μg·mL-1）的有机酸标准溶液，对水芹样品的加标回收率进行测定和计算。结果显示，经过加标后，水芹样品中25种有机酸的回收率在50.39%～125.32%，表明该方法准确度较高，适于水芹样品中有机酸含量的测定。

2.4 有机酸含量测定结果

由表5可知，金陵1号水芹不同器官中均含有丙酸、异丁酸、丁酸、草酸、乳酸、戊酸、异戊酸、丙二酸、己酸、异己酸、富马酸、琥珀酸、苯甲酸、衣康酸、戊二酸、苹果酸、水杨酸、辛酸、己二酸、酒石酸、莽草酸、柠檬酸、DL-异柠檬酸、奎尼酸等24种有机酸，庚二酸仅在茎和叶中含有，不同器官中总有机酸的含量由高到低依次为根（35 754.38 μg·g-1）＞茎（8 245.21 μg·g-1）＞叶（4 991.77 μg·g-1）。比较水芹不同器官中单种有机酸含量发现，己二酸、莽草酸和水杨酸在叶中的含量显著高于根，而在根和茎之间差异不显著；衣康酸和柠檬酸在根中的含量显著高于茎和叶，而在茎、叶间差异不显著；戊酸和丙酸在叶中的含量显著低于根和茎，而在根、茎间差异不显著；异己酸和丁酸在根中的含量显著高于叶，而在茎、叶间差异不显著；琥珀酸在叶中的含量显著高于根和茎，而在根、茎间差异不显著；草酸在根中的含量显著高于茎，在茎中的含量显著高于叶；乳酸在叶中的含量显著高于茎，而在根、茎间差异不显著；丙二酸在茎中的含量显著高于根和叶，而在根、叶间差异不显著；戊二酸在叶中的含量显著高于茎，在茎中的含量显著高于根；DL-异柠檬酸在根中的含量显著高于叶，而在叶中的含量显著高于茎；苯甲酸在茎中的含量显著高于叶，而在根、叶间差异不显著；其他有机酸在不同器官中的含量差异不显著。此外，草酸在金陵1号水芹根和茎中有机酸含量最高，分别为（32 094.08±1 600.77） μg·g-1和（5 935.07±437.55） μg·g-1，分别占根和茎中总有机酸含量的89.76%和71.98%；琥珀酸和苹果酸在水芹叶片中均具有较高的含量，分别为（1 381.23±253.74） μg·g-1和（1 399.69±305.15） μg·g-1，分别占叶中总有机酸含量的27.67%和28.04%。

3 讨论与结论

笔者通过HPLC-MS法对无土栽培水芹品种金陵1号不同器官中的有机酸种类和含量进行测定，在本研究的色谱条件下，样品色谱图峰形较好、分离度高、间距合理，能直观反映样品中的有机酸含量，且梯度浓度有机酸标准品溶液的回归方程相关系数在0.991 0～0.999 9，说明各有机酸在浓度范围内均具有良好的线性关系，可通过该标准曲线计算水芹样品中的有机酸含量；并对样品中有机酸的日内稳定性和日间稳定性以及加标回收率进行检测分析，结果显示，样品中25种有机酸的日内稳定性在0.28%～3.99%，日间稳定性在0.41%～6.63%，加标回收率在50.39%～125.32%，说明水芹样品稳定性较好，加标回收良好，表明该方法适于样品中有机酸含量的测定。

测定结果显示，在无土栽培金陵1号水芹不同器官中共含有25种有机酸，总有机酸含量由高到低依次为根（35 754.38 μg·g-1）＞茎（8 245.21 μg·g-1）＞叶（4 991.77 μg·g-1），可见金陵1号水芹中的有机酸种类丰富，含量较高。比较单种有机酸在各器官中的含量，发现根中含量最高的有机酸为草酸，高达（32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1，占根中总有机酸含量的89.76%，约为叶中草酸含量的107倍；茎中含量最高的有机酸也为草酸，高达（5 935.07 ± 437.55） μg·g-1，占茎中总有机酸含量的71.98%，其次为苹果酸，含量高达（1 231.84 ± 212.25） μg·g-1，占比14.94%；叶中琥珀酸和苹果酸均具有较高的含量，分别为（1 381.23 ± 253.74） μg·g-1和（1 399.69 ± 305.15） μg·g-1，占叶中总有机酸含量的27.67%和28.04%，说明水芹不同器官中有机酸组分各不相同。其中，根中草酸含量最高，可能是因为植物需要通过根系分泌草酸等有机酸，提高土壤中的可溶性磷含量和生物有效性[33]。其次，草酸在植物对外界胁迫环境的适应以及抗逆过程中发挥着重要作用，而金陵1号水芹根系庞大，根中有机酸含量最高，这在一定程度上解释了其对低温等逆境环境适应性的原因[1，34-35]。然而，草酸会与人体肠道中的Ca2+结合形成草酸钙，阻碍对Ca2+的吸收，因此，草酸含量过高会影响蔬菜或者水果的品质[36]。而茎中草酸含量较高，可能会降低水芹茎段的食用品质，但水芹茎段中的可溶性糖、维生素C等营养成分丰富[1]，同时有机酸中苹果酸、柠檬酸和琥珀酸含量较高，使得茎段口感风味更佳且营养价值高[37]，而三者在叶中含量较高，使得叶片具有较好的口感，因此，这也是人们主要食用水芹茎段和叶片的原因之一[37]。此外，莽草酸和奎尼酸在金陵1号水芹茎叶中均有较高的含量，分别为（136.15 ± 13.78）、（196.63 ± 71.86）、（412.16 ± 51.81）、（1 018.15 ± 697.28） μg·g-1。研究表明，莽草酸具有抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、治疗饮食肥胖等丰富的药用功效[38-41]，可用于合成去角质剂、抗禽流感病毒药物、抗酶活性剂等多种化学品[41-42]；而奎尼酸已被报道具有抗氧化、抗炎等功效[43-44]，此外，奎尼酸还可用作肿瘤化疗药物在人体内运输的载体，促进药物在体内肿瘤中的分布，从而减少所需药物的使用剂量和非特异毒性[41，45]。因此，可将金陵1号水芹用于提取奎尼酸和莽草酸或开发为相关功能保健食品，具有较大的资源化利用潜力。

综上，笔者通过高效液相色谱质谱联用方法对金陵1号水芹中的有机酸进行检测，发现水芹中有机酸种类丰富且含量较高，茎叶中的苹果酸、琥珀酸和柠檬酸使得水芹具有较好的口感和风味，同时具有丰富的可溶性糖、粗脂肪、矿质元素等营养成分[1]，因此，水芹的茎段和叶片成为人们日常食用的主要部分。根中草酸含量高达（32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1，可能是水芹抗逆性好、适应性强的主要原因之一。此外，水芹茎叶中莽草酸和奎尼酸的含量较高，可用于莽草酸和奎尼酸的提取和功能保健食品的开发，资源化利用潜力巨大。

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