金匮肾气丸对糖尿病性阿尔茨海默病模型小鼠脑神经元凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

郭学军 陈苑 高欣

(广州中医药大学动物实验中心,广东 广州 510400)

阿尔茨海默病(AD)是以记忆力损害、认知功能障碍为主要表现的神经系统退行性疾病,AD患者主要有神经元丢失、β淀粉样蛋白(Aβ)聚集、神经纤维缠结等病理特征〔1,2〕。AD与糖尿病疾病在流行病学、组织病理学、分子生化特征等方面具有相关性,2型糖尿病可显著增加AD发生的概率,AD又被称为“3型糖尿病”,糖尿病性AD病程长、治疗费用高,给患者及其家庭带来沉重负担,因此探究治疗糖尿病性AD疾病的新型药物成为近年研究热点〔3,4〕。糖尿病古称“消渴”“脾瘅”,AD属于“呆症”“愚痴”“健忘”等范畴,肾虚是AD发病的重要病理基础之一,金匮肾气丸主要用于肾虚水肿、腰膝酸软、阴阳两虚等疾病的治疗,可改善糖尿病患者胰岛素抵抗、葡萄糖稳态,能减少AD模型大鼠脑部Aβ沉积和神经元损伤,可能对糖尿病性AD具有一定治疗效果〔5,6〕。磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路是机体内重要的信号传导通路,与细胞增殖、分化、凋亡等生物学活动联系密切,在AD患者Aβ沉积、糖尿病患者胰岛素水平调节中发挥重要作用〔7,8〕。本研究探究金匮肾气丸对糖尿病性AD小鼠脑神经元凋亡及PI3K/Akt通路的影响。

1 资料与方法

1.1动物 APP/PS1转基因AD小鼠(南京大学-南京生物医药研究院),生产许可证号为SCXK(苏)2015-0001,体质量约20 g。所有小鼠在广州中医药大学动物实验中心SPF级动物房中饲养,温度25 ℃左右,相对湿度50%左右。实验过程中按照动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀且经动物伦理委员会批准。

1.2主要试剂及仪器 金匮肾气丸(Z11020147)购于北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂;链脲佐菌素(STZ,货号:T1507)购于陶素生化;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法,C1091)购于上海碧云天;小鼠Aβ42酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号:CS-ELISA1124)购于上海莼试生物技术有限公司;组织裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(货号:R0010、PC0020)购于北京索莱宝科技有限公司;兔源PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、GAPDH一抗、羊抗兔IgG抗体(货号:ab32089、ab8805、ab278545、ab38449、ab9485、ab6721)购于Abcam。血糖检测仪(型号BIOSENC-Line Clinic 20)购于北京德福康科贸有限公司;光学显微镜(型号SMZ745)购于日本尼康公司;血液流变分析仪(型号HL-5000)购于泰安市康宇医疗器械有限公司;酶标仪(型号AMR-100)购于杭州奥盛仪器有限公司;凝胶成像仪(型号GIS-500)购于Miulab公司等。

1.3动物模型制备及分组给药 糖尿病性AD小鼠模型的构建参考文献〔9〕并稍作修改,50只APP/PS1转基因AD小鼠随机分为对照组(10只)、造模小鼠(50只),对照组小鼠普通饲料(58.8%碳水化合物、15.4%脂肪、蛋白质25.8%)喂养,造模小鼠高脂饲料(20%蛋白质、40%脂肪、40%碳水化合物)连续喂养4 w,第4周末禁食12 h,造模组小鼠一次性腹腔注射的65 mg/kg的STZ溶液(1%,STZ溶解于pH为4.4的柠檬酸钠-柠檬酸溶液中),对照组腹腔注射等量柠檬酸钠-柠檬酸溶液,注射完成后72 h进行尾静脉取血,测定其中血糖值,连续3次空腹血糖(FBG)>16.8 mmol/L,有多饮、多尿、多食症状为糖尿病性AD造模成功。造模期间有不符合条件或死亡现象发生,及时选取备用小鼠进行造模实验。将造模成功的糖尿病性AD小鼠分为模型组、金匮低剂量组(0.35 g/kg)、金匮中剂量组(0.70 g/kg)、金匮高剂量组(1.40 g/kg),每组10只,按照各组给药剂量进行灌胃处理,对照组以生理盐水替代,持续灌胃30 d,2次/d。按照人体表法计算金匮肾气丸的小鼠给药剂量,成人金匮肾气丸每次用量为5 g,2次/d,按照成人体质量60 kg,换算系数采用8.5,则将低、中、高给药剂量分别设定为0.35、0.70、1.40 g/kg。

1.4小鼠行为学检测 末次给药结束后24 h采用Morris水迷宫实验对各组小鼠进行行为学检测,水迷宫测试仪圆形水池等分为4个象限(分别称为1、2、3、4象限),半径5 cm的圆形透明平台低于水平面1 cm置于第1象限中央。定位巡航实验:将小鼠每天同一时间从第2、3、4象限放入水池中,记录大鼠从入水到爬上圆形透明平台的时间(潜伏期),潜伏期值越大表明大鼠认知功能较差,90 s内未找到圆形透明平台,引导其到平台上并停留10 s,潜伏期记为90 s,每只动物每天训练4次,共训练4 d。空间探索实验:第5天将圆形透明平台撤去,记录小鼠在120 s内游过平台区域的次数,次数越多代表小鼠记忆能力越好。

1.5小鼠血液指标及脑组织Aβ42含量检测 取各组小鼠0.1 ml空腹静脉血,用血糖仪检测血糖水平,用血液流变分析仪测定全血黏度、血浆黏度、血细胞比容、红细胞变形指数。取小鼠空腹尾静脉血,离心取血清,采用放射免疫分析法测定其中胰岛素水平。取小鼠脑组织适量,用Aβ42 ELISA测定其中Aβ42含量,具体操作参考试剂盒说明书的要求。胰岛素抵抗指数HOMA-IR=(血糖水平×胰岛素水平)/22.5。

1.6小鼠海马组织神经元凋亡情况检测 将小鼠麻醉后处死,脑部皮肤消毒后依次切开皮肤、肌肉、骨膜,分离颅骨使脑组织暴露,用手术刀小心分离小鼠海马组织。取5只小鼠海马组织,在4%多聚甲醛中固定48 h,用生物组织脱水机对海马组织进行脱水、透明处理,将经过透明处理的海马组织浸于融化的石蜡中,待包埋有海马组织的石蜡凝固后进行修剪,用组织切片机切成厚度约4 μm的切片,将切片经过二甲苯脱蜡、乙醇脱水、多聚甲醛再次固定、磷酸盐缓冲液冲洗、蛋白酶K通透性处理后放于湿盒中平衡10 min,加入原位末端标记法(TUNEL)反应液避光反应1 h,磷酸盐缓冲液冲洗后加入转化剂处理30 min,磷酸盐缓冲液冲洗,加入二氨基联苯胺(DAB)显色液,观察到浅棕色背景后用去离子水冲洗,经过苏木素复染、冲洗、脱水、透明、封片后于显微镜下观察并分析。神经元凋亡率(%)=棕褐色细胞(阳性细胞)/视野总细胞×100%。

1.7小鼠海马组织凋亡相关蛋白及PI3K/Akt通路蛋白表达检测 取5只小鼠海马组织适量,用眼科剪剪碎后加入组织裂解液提取其中总蛋白,1 000 r/min 4 ℃离心10 min后吸取上清液,用BCA蛋白测定试剂盒测定其中蛋白质浓度,用组织裂解液将各组蛋白浓度调至相同,高温加热至蛋白质变性,取20 μl变形蛋白溶液上样,进行聚丙烯酰胺凝胶实验分离蛋白,湿转法将分离的蛋白转移至硝酸纤维膜上,用5%的脱脂奶粉封闭处理2 h,分别加入兔源PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、GAPDH一抗(1∶500),4 ℃环境孵育过夜,用TBST缓冲溶液冲洗后加入羊抗兔二抗IgG(1∶1 000),用TBST缓冲溶液冲洗后显色,于凝胶成像仪中观察并分析各组小鼠海马组织中蛋白表达情况。

1.8统计学分析 采用GraphPad Prism8软件进行方差分析,进一步两组间比较进行LSD-t检验。

2 结 果

2.1金匮肾气丸对糖尿病性AD小鼠行为学影响 潜伏期的时间变化与组别存在交互效应(P<0.05)。随着训练时间的延长,各组小鼠潜伏期呈现降低趋势;与对照组相比,模型组潜伏期显著升高,穿台次数显著减少(均P<0.05);与模型组相比,金匮各剂量组潜伏期显著降低,穿台次数显著升高(均P<0.05),且呈现一定的剂量依赖效应,其中金匮高剂量组效果较好。见表1。

表1 各组行为学检测

2.2金匮肾气丸对糖尿病性AD小鼠血液流变学指标的影响 与对照组相比,模型组全血黏度、血浆黏度、血细胞比容、红细胞变形指数显著升高(P<0.05);与模型组相比,金匮各剂量组全血黏度、血浆黏度、血细胞比容、红细胞变形指数显著降低,且呈现一定的剂量依赖效应,其中金匮高剂量组效果较好。见表2。

表2 各组血液流变学指标、血糖水平及血清胰岛素水平比较

2.3金匮肾气丸对糖尿病性AD小鼠血糖及胰岛素水平的影响 与对照组相比,模型组血糖水平、血清胰岛素水平、HOMA-IR、脑组织Aβ42含量显著升高(均P<0.05);与模型组相比,金匮各剂量组血糖水平、血清胰岛素水平、HOMA-IR、脑组织Aβ42含量显著降低(P<0.05),且呈现一定的剂量依赖效应,其中金匮高剂量组效果较好。见表2。

2.4金匮肾气丸对糖尿病性AD小鼠脑神经元凋亡的影响 与对照组相比,模型组神经元细胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达水平显著升高,Bcl-2蛋白表达水平显著降低;与模型组相比,金匮各剂量组神经元细胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达水平显著降低,Bcl-2蛋白表达水平显著升高(均P<0.05),且呈现一定的剂量依赖效应,其中金匮高剂量组效果较好。见表3、图1、图2。

1～5:对照组、模型组、金匮低、中、高剂量组;下图同图2 各组凋亡相关蛋白表达

表3 各组脑神经元凋亡率、凋亡相关蛋白表达及海马组织PI3K/Akt通路蛋白表达比较

2.5金匮肾气丸对糖尿病性AD小鼠海马组织PI3K/Akt通路蛋白表达的影响 与对照组相比,模型组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,金匮各剂量组小鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著升高(P<0.05),且呈现一定的剂量依赖效应,其中金匮高剂量组效果较好。见表3、图3。

图3 各组海马组织PI3K/Akt通路蛋白表达

3 讨 论

以前AD和糖尿病常作为两项独立的代谢疾病进行研究,近年来的研究发现糖尿病认知障碍患者的发病率不断增加,许多流行病学都将AD与糖尿病的发生联系在一起,研究证实糖尿病患AD的概率远远高于非糖尿病人群,糖尿病血糖水平紊乱、胰岛素抵抗被认为是糖尿病增加AD相关病理的主要机制之一〔10～13〕。

传统中医认为糖尿病属于“消渴”范畴,阴虚为主、燥热为标,有脾肾亏虚等生理特点,AD属于中医“呆症”范畴,多有脾肾亏虚、脑髓不充、清阳不升等表现,脾肾亏虚为主的脏器功能衰退可加重患者脑神经元损伤、Aβ沉积,造成脑神经元大量凋亡,进而导致患者认知功能障碍加剧〔6,14〕。中药治疗具有作用温和、持久、不良反应小等多种优点,金匮肾气丸含有地黄、山药、山茱萸、茯苓等多种传统中药,有补肾益智之功效,在改善、治疗糖尿病方面存在一定的优势,在改善老年痴呆患者生活活动能力、认知功能等方面具有较好的疗效〔15,16〕。本研究结果提示金匮肾气丸可显著改善糖尿病AD小鼠的认知功能障碍等不良表现。

PI3K/Akt通路是机体内重要的信号传导通路,在细胞存活、增殖、凋亡等生物学活动中发挥重要作用,与AD患者神经元凋亡、脑组织氧化应激等反应联系密切,PI3K通过磷酸化肌醇环上的3位羟基生成二磷酸磷脂酰肌醇,进而将信号传递给下游蛋白并激活Akt,激活的PI3K/Akt通路具有促进细胞生存、抗细胞凋亡等作用〔17,18〕。Li等〔19〕研究发现激活PI3K/Akt通路对于AD后脑神经元的恢复具有促进作用,Wang等〔20〕研究发现激活PI3K/Akt通路可降低小鼠血糖水平,减轻2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗。本研究结果提示金匮肾气丸具有改善糖尿病性AD小鼠神经元凋亡、胰岛素抵抗的作用可能与激活PI3K/Akt通路有关;但本文未设置相应的通路抑制剂或激活剂进行对比实验,接下来应通过设置相关对比实验验证金匮肾气丸的作用机制。