丹参有效成份配伍对ApoE-/-小鼠心脏的保护作用及TLR4/NF-κB通路的影响

吴江立 徐红俊 崔清卓 周路阳 赵薇 周勇杰 张宇 宁浚达 冯慧敏 安胜军,

(1河北中医学院科研中心,河北 石家庄 050200;2河北省植物生物反应器制备技术工程实验室;3河北中医学院中西医结合学院)

动脉粥样硬化是诱发心血管疾病的主要因素,病变累及主动脉和冠状动脉。如果冠状动脉血管壁上脂质大量沉积,血管壁增厚,会进一步形成斑块,堵塞血管,导致心肌缺血,进一步可引发心肌梗死〔1〕。ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠常用于高血脂、动脉粥样硬化等疾病的造模。有研究报道,血液中胆固醇含量过高与心室重构有密切关系〔2〕。有关ApoE-/-小鼠发生心肌损伤的机制和药物治疗作用的相关报道很少。丹参是唇形科植物丹参的根,在中医古籍中有记载“一味丹参,功同四物”。目前在临床上已经广泛用于心脑血管疾病的治疗。丹参的传统使用方式为煎煮,其有效活性成分可以在水中溶解。关于丹参水提物的研究有许多新的发现。例如,丹酚酸(Sal)-A可以减弱ApoE-/-小鼠主动脉瘤的形成〔3〕,抗心肌缺血〔4〕。Sal-B具有抑制成纤维细胞迁移和转化的作用〔5〕,丹参素(DSS)可阻止心室重构〔6〕。原儿茶醛(PAL)对心血管系统具有抗炎和抗动脉粥样硬化的保护作用。中药配伍是临床用药的主要形式,有效成分组合是中药配伍的新模式。实验室前期研究〔7〕确定了其最佳配伍组合并命名为SABP(Sal-A+Sal-B+DSS+PAL),且发现SABP可以降低血压,改善血管重构。但SABP 是否对心脏有保护作用尚不得知。本研究主要观察SABP是否对ApoE-/-小鼠的心脏具有保护作用并探索其可能的机制。

1 材料和方法

1.1药物和试剂 DSS(76822-21-4)、Sal-A(96574-01-5)、Sal-B(115939-25-8)和PAL(139-85-5)购自上海扶生有限公司;Toll样受体(TLR)4抗体购自上海江莱生物科技有限公司;核转录因子(NF)-κB p65(GB11142)、白细胞介素(IL)-6(GB11117)、转化生长因子β激活激酶(TAK)1(GB11701)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(GTX110520)和组蛋白H3 (GB13102-1)抗体购自武汉塞维尔公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,AC033)抗体购自Abclonal公司;羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自KPL公司,核蛋白提取试剂盒(P0027)购自碧云天生物技术公司。

1.2实验动物和处理 30只雄性ApoE-/-小鼠和10只C57BL/6J小鼠(6周龄,体质量18～22 g)购自北京维通利华实验动物有限公司。实验动物生产许可证:2016-0010。小鼠饲养在一个标准的环境下(12 h光照/黑暗周期,22 ℃),自由饮食和饮水。适应1 w后,30只ApoE-/-小鼠随机分为:模型(Model)组、SABP组、润舒伐他汀(RC)组;C57BL/6小鼠作为正常对照(Control)组。RC组每天腹腔注射0.4 mg/kg 的RC,SABP组每天腹腔注射丹参四种水溶性成分的有效组合(DSS:5 mg/kg,Sal-A:0.233 mg/kg,Sal-B:10.000 mg/kg,PAL:17.000 mg/kg)。Control组和Model组小鼠每天腹腔注射等剂量的生理盐水。8 w后,麻醉小鼠,收集血清和心脏。

1.3血清脂类测量 通过全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC),三酰甘油(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。

1.4组织形态学研究 心脏固定在4%多聚甲醛,梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、在切片机上切出厚度6 μm左右的切片,苏木素-伊红(HE)染色观察心脏形态学改变。

1.5免疫组化 将心脏组织切片在60 ℃烘箱烘烤1 h,随后二甲苯脱蜡,梯度酒精复水,用柠檬酸缓冲液进行高压修复抗原,冷却至室温后,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,随后加入TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α进行孵育过夜,PBS清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗,二氨基联苯胺(DAB)显色,中性树胶封片后观察。

1.6Western印迹检测蛋白变化 将心脏组织匀浆,根据说明书提取总蛋白和核蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒对蛋白进行定量。随后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%的脱脂奶粉室温封闭2 h,一抗孵育过夜〔TLR4(1∶1 000),NF-κB(1∶1 000),IL-6(1∶1 000),TAK-1(1∶750),GAPDH(1∶10 000)和H3(1∶10 000)〕,随后用辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗孵育,电化学发光(ECL)显色,在凝胶成像系统成像。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1SABP对血清脂类的影响 如表 1所示,与Control组比较,Model组血清TC、TG和LDL-C水平明显升高,HDL-C水平显著降低(P<0.05);与Model组比较,SABP组显著降低血清TG、TC和LDL-C水平(P<0.05);RC组血清脂类水平和Model组相比无统计学差异(P>0.05)。

2.2SABP对心脏形态学的影响 如图1所示,心脏组织的HE染色显示,Control组心肌纤维排列整齐,心肌细胞核位于细胞中心,呈椭圆形或者圆形,细胞质呈粉色,均一,心肌纤维未见明显增厚、充血等病变。Model组心脏心肌细胞排列比较松散、心肌细胞大小不一,胞质染色不均匀,局部淡染。SABP和RC组心肌细胞排列较整齐,胞质染色均匀,心肌结构接近正常。

2.3SABP对心脏TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的影响 免疫组化和Western印迹结果显示,与Control组相比,Model组心脏组织中TLR4、TAK1、IL-6和TNF-α表达增多,NF-κB被激活(P<0.05),见表2、表3,SABP和RC可以显著降低心脏组织中TLR4、TAK1、IL-6和TNF-α的表达,抑制NF-κB激活(P<0.05),见图2、图3。

图2 Western印迹检测各组心脏中TLR4、NF-κB、IL-6和TAK1表达

图3 免疫组化检测TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α在各组心脏中表达(×200)

表2 免疫组化检测各组TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α表达

3 讨 论

ApoE-/-小鼠无论饲喂基础饮食还是高脂饮食均可形成高脂血症。血脂在血管壁沉积可进一步导致动脉粥样硬化,如若发生在冠状动脉,心肌细胞缺血缺氧,进一步导致心脏功能减退、心肌纤维化,心室发生重构〔8,9〕。有文献报道,ApoE-/-小鼠正常饮食7个半月,显示出明显的心脏重构〔10〕,也有报道称4周龄ApoE-/-小鼠正常饮食出现左心室肥大〔11〕。本实验说明饲喂普通饮食8 w ApoE-/-小鼠出现了严重的高脂血症;丹参四种水溶性成分的有效组合SABP可以降低ApoE-/-小鼠血脂;6周龄ApoE-/-小鼠饲喂基础饮食8 w发生了心肌组织损伤。经SABP治疗后,心肌组织形态学改变有所改善。说明SABP可以减少ApoE-/-小鼠心肌组织损伤,对心脏有一定的保护作用。

证据表明,炎症可参与多种心血管疾病的发生和发展。TLR4/NF-κB信号通路通过调节炎症因子的分泌参与心肌损伤的病理生理过程〔12〕。TLR4通过一系列信号分子激活NF-κB,进而促进IL-6,TNF-α、TAK1等炎症因子的分泌增加,损伤心肌组织。减少炎症通路中相关蛋白和炎症因子的表达,在心肌损伤的治疗中发挥非常重要的作用。本研究结果说明,炎症参与了ApoE-/-小鼠心脏损伤,SABP可以显著降低模型组心肌组织中TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α和TAK1等蛋白的表达,说明SABP可通过下调TLR4/NF-κB通路的关键蛋白表达,减少炎症因子的分泌,进而减轻ApoE-/-小鼠心脏的损伤。

综上,丹参四种水溶性成分的有效组合SABP具有降低ApoE-/-小鼠血脂、减轻心脏损伤的作用,其机制可能与调控TLR4/NF-κB信号通路有关。本研究为SABP治疗心血管疾病提供了实验依据。