基于Wnt/β-catenin信号通路探讨骨补丸延缓老年膝骨关节炎软骨退变机制

包杭生 关宏刚 梁钰英 冯宗权 刘伟明 陈国涛 周活龙 王鼎 邹勇根

(佛山市中医院骨伤科,广东 佛山 528000)

膝骨关节炎(KOA)在老龄人群中具有高发病率、高危害性,成为广大学者关注的焦点〔1〕。调查发现,60岁以上的女性中几乎有一半是KOA患者〔2〕。我国健康与养老追踪调查数据库显示症状性KOA发病率为8.1%,女性高于男性〔3〕。老年KOA严重者将影响患者生活质量〔4〕。研究认为,KOA是由各种复杂因素在炎症因子及其相关信号通路的介导下引发的骨性疾病〔5〕。Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路通过细胞凋亡途径发挥调控效应〔6〕,其相关蛋白和受体与KOA的发生发展密切相关〔7〕。

KOA中医学称为膝痹〔8〕。《张氏医通》记载有“膝痛”:膝者筋之府,屈伸不能,行则偻附,筋将惫矣。故膝痛无有不因肝肾虚者,虚则风寒湿气袭之。《圣济总录》记载:肾脂不长,则髓涸而气不行,骨乃痹而其证内寒也。故KOA多以正气内虚、肝肾不足为主要病机,以补益肝肾、强筋壮骨为主要治则。骨补丸(曾用名骨宝丸)是佛山市中医院骨伤科长期临床实践总结的常用院内制剂,具有补肾填精益髓、强筋壮骨通络的功效,适用于肝肾亏虚型老年KOA,已由前期动物与临床研究证实〔9～11〕。基于中医药调控Wnt/β-catenin信号通路可能是防治KOA的关键机制〔12〕,本文从该信号通路探讨骨补丸改善关节功能、抑制滑膜炎症、延缓软骨退变、促进软骨修复的临床疗效及其作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 以随机数字表法将2021年1～6月佛山市中医院治疗的128例肝肾亏虚型老年KOA患者分成试验组、对照组各64例。男46例,女82例;年龄60～79岁,平均(66.32±5.21)岁;病程1～10年,平均(4.22±3.38)年;X片Kellgren-Lawrence(KL)分级:Ⅰ级21例,Ⅱ级43例,Ⅲ级41例,Ⅳ级23例。两组一般资料(性别、年龄、病程、KL分级等)差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。本课题通过佛山市中医院伦理委员会批准(研究方案版本号20200202),取得所有受试对象知情同意(知情同意书版本号20200205),并在医学研究登记备案信息系统备案(备案编号MR-44-21-007340)。

表1 两组一般资料

1.2诊断标准 KOA诊断标准:根据《骨关节炎诊疗指南(2018年版)》制定〔13〕:①近1个月内反复的膝关节疼痛;②X线片(站立位或负重位)示关节间隙变窄、软骨下骨硬化和(或)囊性变、关节边缘骨赘形成;③年龄≥60岁;④晨僵时间≤30 min;⑤活动时有骨摩擦音(感)。满足①+(②、③、④、⑤条中的任意2条)者。肝肾亏虚证候诊断标准:参照《中医骨伤科临床诊疗指南·膝痹病(膝骨关节炎)》制定〔14〕:①主症:关节隐隐作痛;②次症:腰膝酸软无力,酸困疼痛,遇劳更甚。舌质红,少苔,脉沉细无力。

1.3纳入标准 ①符合上述西医疾病诊断标准及中医证候诊断标准;②X线片示KL分级为Ⅰ～Ⅳ级;③就诊之前4 w内未服用任何含有骨补丸组成的中药或中成药;④患者知情同意。

1.4排除标准 ①膝关节肿瘤、风湿、类风湿、结核、化脓、骨髓炎、痛风、骨折或严重创伤急性期;②严重肝肾功能损害,转氨酶>正常上限值的3倍,血尿素氮和血清肌酐>正常上限值的2倍;③循环、呼吸、消化、血液、内分泌系统等严重原发性疾病;④语言、听力、认知功能障碍、精神疾病等无法进行有效沟通;⑤已知对试验药物(骨补丸组方中的任意一味中药或中成药、玻璃酸钠、氨基葡萄糖类、非甾体抗炎药)过敏;⑥研究者认为其他需要排除的因素。

1.5终止临床试验标准 ①用药依从性<80%;②发生严重不良事件,如皮肤严重过敏、消化道大出血等;③受试者不能坚持治疗,主动要求退出。

1.6试验药品 ①骨补丸:规格每袋装6 g,批准文号粤药制字Z20060052,佛山市中医院院内制剂中心生产;②玻璃酸钠注射液:商品名阿尔治,关节内注射剂,规格2.5 ml(25 mg),进口药品注册证号H20090719,日本生化学工业株式会社高萩工长生产;③盐酸氨基葡萄糖胶囊:商品名奥泰灵,0.75 g/粒,医药产品注册证号HC20140007,香港澳美制药厂生产;④塞来昔布胶囊:商品名西乐葆,200 mg/片,进口药品注册证号H20120355、H20120354,辉瑞制药有限公司生产包装;⑤安慰剂:仿造骨补丸外形,原料为面粉,达到可食用级别灭菌后包装,规格每袋装6 g,佛山市中医院院内制剂中心提供。

1.7治疗方法 ①西医常规治疗:两组均给予玻璃酸钠关节腔内注射,1次/w,连续4 w。口服盐酸氨基葡萄糖胶囊,2次/d,每次1粒,饭后服用,连续4 w。口服塞来昔布胶囊,1次/d,每次1粒,饭后服用,连续4 w;②试验组:口服骨补丸,3次/d,1袋/次,饭后服用,连续4 w;③对照组:口服安慰剂,3次/d,1袋/次,饭后服用,连续4 w。

1.8观察指标 ①功能量表评分:分别于治疗前、治疗后由同一组临床医师采用西安大略和麦马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)〔15〕、日本骨科协会评估治疗分数(JOA)〔16〕、膝关节Lysholm功能评分〔17〕3种不同功能量表评分。WOMAC评分由关节疼痛、僵硬和关节功能3个项目组成,总分96分,分值与功能呈负相关。JOA评分由疼痛及步行能力、疼痛及上下楼梯能力、屈度角度及强直与高度挛缩、肿胀4个项目组成,总分100分,分值与功能呈正相关。Lysholm评分由跛行、支撑、交锁、膝软、疼痛、肿胀、爬楼梯、下蹲8个项目组成,总分100分,分值与功能呈正相关。②超声影像测量滑膜厚度:分别于治疗前、治疗后由同一组超声医师采用Philips iu22型超声仪测量。取仰卧位,伸直下肢,显露膝关节,设置探头频率为8～15 MHz,扫查膝关节前上方,探测膝关节髌上囊滑膜,收集滑膜厚度数据,测量3次取平均值。③磁共振成像(MRI)影像测量髌骨面、滑车面软骨T2值:分别于治疗前、治疗后由同一组MRI医师采用Philips Achieva 3.0T TX多源发射MRI仪测量。使用SENSE8通道相控阵膝关节线圈,T2图成像采用6回波自旋回波(SE)序列1次扫描,参数为:重复时间(TR)/回波时间(TE)=2 400 ms/15、30、45、60、75、90 ms,层厚5 mm,间隔0.5 mm,视野(FOV)16 cm×16 cm,矩阵320×512,重复次数(NSA)=1,扫描时间5 min 54 s。将扫描图像传递到Philips EWS工作站,获取膝关节软骨的T2-mapping伪彩图像,选取髌骨面、滑车面2个兴趣区的关节软骨T2值,均测量3次取平均值。④Wnt/β-catenin信号通路因子:分别于治疗前、治疗后抽取左肘正中静脉血5 ml,放置于无菌乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2抗凝管中,实时荧光定量聚合酶链反应检测Wnt-3a、β-catenin、骨形态发生蛋白(BMP)-2 mRNA的表达量。设定β-catenin作为内参,依据2-△△Ct方法计算获取相对定量数值。本检测委托广州金域医学检验中心完成。⑤安全指标:如实记录任何不良事件,包括全身不良反应、局部皮肤不良反应、消化道不良反应等出现的时间及症状体征,是否需停药及处理措施等。

1.9统计学方法 采用SPSS22.0软件,计数资料采用Pearsonχ2检验。计量资料若服从正态分布,且各组总体方差齐,则选择参数统计,组内比较采用配对设计t检验,组间比较采用独立样本设计t检验;否则选择非参数统计。

2 结 果

2.1功能量表评分 病例均获得随访。两组治疗前WOMAC、JOA、Lysholm评分比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组各指标分别与治疗前比较,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后试验组以上指标改善显著优于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组功能量表评分分,n=64)

2.2影像学测量指标 两组治疗前滑膜厚度、髌骨面软骨T2值、滑车面软骨T2值比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后,两组以上指标分别与治疗前比较,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后试验组以上指标改善显著优于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组影像学测量指标

2.3Wnt/β-catenin信号通路因子 两组治疗前Wnt-3a、β-catenin、BMP-2 mRNA比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组以上指标分别与治疗前比较,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后试验组以上指标改善明显优于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 两组Wnt/β-catenin信号通路因子比较

2.4安全指标 试验期间,两组均无不良反应事件发生。

3 讨 论

老年KOA是常见而多发的慢性进行性关节疾病〔18〕,具体发病原因和发病机制尚未完全阐明〔19〕。KOA主要病理过程是关节滑膜的增生、肥厚,软骨的降解、破坏,软骨下骨的囊性变、继之硬化,边缘性骨赘形成〔20〕,这一过程由炎症因子在相关信号通路的介导下实现。研究证实,Wnt/β-catenin信号通路通过调控关节软骨发育、骨化、重塑、骨折修复等,参与KOA的发生与发展〔21〕。Wnt家族有19个成员蛋白〔22〕,其中Wnt-3a是骨代谢的主要调节因子,Wnt-3a促进成骨细胞增殖或早期成骨细胞分化,并抑制成骨细胞的成熟或矿化〔23〕。β-catenin是Wnt/β-catenin通路中最关键的成骨因子,β-catenin作为多功能胞质蛋白,其异常表达能够加剧骨质破坏和吸收进程,干扰骨质重建〔24〕。BMP-2则是唯一可以诱导间充质细胞朝向骨组织分化的因子,广泛参与成骨过程,与成骨速率呈明显负相关〔25〕,其活跃浓度提示KOA炎症反应的严重程度。本研究提示,Wnt/β-catenin通路是调控骨代谢的重要途径,Wnt-3a、β-catenin、BMP-2在该通路中发挥独特作用,下调这三者的表达水平可延缓KOA病程发展,对这三者的调控可成为KOA的治疗标靶〔26〕。

骨补丸由熟地黄、山茱萸、山药、淫羊藿、龟板胶、鹿角胶、仙茅、杜仲等多种中药组成。骨补丸以六味地黄汤之“三补”为其组方框架,熟地黄、山茱萸、山药为君药,淫羊藿、龟板胶、鹿角胶为臣药,仙茅、杜仲为佐使药,具有补益精髓、壮骨通络之功效。从单味中药分析,陈烨等〔27〕证实,山茱萸颗粒能抑制Wnt4、β-catenin的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。孙雯雯等〔28〕发现,山药提取物能下调Wnt/β-catenin通路中关键基因Wnt1的表达。代云龙等〔29〕认为,淫羊藿苷能够降低基质金属蛋白酶(MMP)-9的mRNA相对表达量与β-catenin蛋白表达量,可能具有抑制Wnt/β-catenin信号通路活性的作用。李春等〔30〕观察,龟板提取物具有双向调控毛囊干细胞Wnt/BMP信号通路作用,随着龟板提取物剂量的增加,β-catenin表达水平下降。本研究提示,骨补丸能够调控Wnt/β-catenin信号通路,有效干预老年KOA病程进展,结合功能量表评分及影像学测量指标比较,骨补丸可能通过下调Wnt/β-catenin信号通路Wnt-3a、β-catenin、BMP-2表达水平,发挥其改善关节功能、抑制滑膜炎症、延缓软骨退变、促进软骨修复的治疗作用。

本研究不足之处:一是由于随访时间有限,样本量偏少,缺乏多中心研究;二是由于中药成分的不确定性及Wnt/β-catenin信号通路机制的复杂性,骨补丸调控Wnt/β-catenin信号通路是由其单味中药提取物还是整方复合制剂来干预KOA的机制尚未完全明确。因此,下一步应进行多中心大样本长期随访的前瞻对照试验,对骨补丸成分进行详细分析并结构排列,以骨补丸具体影响Wnt/β-catenin信号通路效应成分及作用标靶作为切入点,以获得更精准的靶向药物。