2型糖尿病患者血浆miR-146a和miR-223的表达研究

杨喜永,徐雪勤,张爱荣,赵小燕,代建宇,郑锡铭

(驻马店市中心医院:1.检验科;2.内分泌科,河南 驻马店 463000)

2型糖尿病(T2DM)是一种慢性自身性免疫代谢性疾病,随着经济的发展和物质生活水平的提升,近年发病率越来越高。目前,糖尿病已成为我国主要的公共卫生问题之一[1-2]。T2DM是一组以胰岛素抵抗和胰岛素敏感性下降导致高血糖水平为特征的代谢综合征,在疾病的发生、发展过程中多有遗传因素、环境多因素的参与,综合病因错综复杂,同时多伴胰岛β细胞功能衰退和胰岛素抵抗。同时,随着病情的进展,高血糖可带来包括心脏病、脑卒中、糖尿病视网膜病变、肾脏衰竭,甚至四肢血流不畅而需要截肢等严重的并发症[3]。

miRNA作为内源性的非编码的微小RNA,可以通过作用于特异性序列抑制靶基因转录、在翻译后水平来调控机体蛋白表达,参与多种炎性和自身免疫性疾病的发病过程[4]。有研究表明,在T2DM患者外周血中存在差异表达的miRNA[5-6],这些差异表达的miRNA提示其可能作为T2DM患者一种潜在的生物学诊断标志物[7]。由于T2DM为非胰岛素依赖型糖尿病,常起病隐匿,病程持续时间长,在早期多无典型的临床表现,如能在机体出现血糖代谢异常的早期和糖尿病前期及时进行饮食干预或药物治疗,可以极大地改善患者胰岛功能,减少患者对胰岛素的抵抗,从而延缓T2DM的发生、发展进程,所以寻找一种特异性的生物学标志物对T2DM的早期诊断具有重要的临床意义[2]。本研究通过检测miR-146a和miR-223在60例健康对照组及126例T2DM患者血浆中的表达水平,以探讨二者对T2DM患者的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年6月至2021年6月本院住院的T2DM患者126例作为T2DM组,诊断均符合《中国2 型糖尿病防治指南》中T2DM的诊断标准[8],其中男66例,女60例;年龄14～78岁,平均(47.63±9.36)岁。另选取在本院体检中心同期进行健康体检者60例作为健康对照组,其中男30例,女30例;年龄16～75岁,平均(46.21±8.13)岁。选取的研究对象均排除其他可能影响机体miRNA表达的疾病及异常情况,同时本组研究获得医院医学伦理委员会的批准,所有参与者均知情同意。

1.2仪器与试剂

1.2.1实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 所有受试者入组后均采集乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝静脉血3 mL,3 000 r/min离心10 min,取上层血浆置于-80 ℃冰箱备用。使用Small RNA提取试剂盒经反转录合成cDNA后保存备用。按照qRT-PCR荧光定量试剂盒操作说明进行荧光定量检测,设置平行复孔,检测结果取平均值。

1.2.2常规生化指标检测方法 记录2组受试者身高、体重,计算体重指数(BMI)。入院空腹8～12 h于次日晨抽取肘静脉血3 mL检测,采用贝克曼Au-5800全自动生化分析仪检测静脉血空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的表达水平,以上所有检测操作严格按照检测仪器及配套试剂检测说明书进行。

2 结 果

2.12组受试者一般情况及常规生化指标比较 T2DM组患者BMI、TG、TC、LDL-C、FPG 和HbA1c均高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2组患者年龄、HDL-C比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组受试者一般情况及常规生化指标比较

2.2血浆miR-146a及miR-223的表达分析 与健康对照组相比,血浆miR-146a在T2DM组患者中的表达量明显升高,而血浆中miR-223的表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组受试者血浆miR-146a及miR-223表达量比较

2.3血浆miR-146a、miR-223与T2DM患者临床常见监测指标的相关性分析 Pearson相关分析显示,miR-146a和miR-223在T2DM患者血浆中存在一定的正相关关系(r=0.445,P<0.05)。miR-146a与病程、TG、TC、LDL-C和FPG 呈正相关(r=0.597、0.656、0.676、0.773、0.735,P<0.05);与BMI、HDL-C和HbA1c无相关性(P>0.05)。miR-223与病程呈正相关(r=0.482,P<0.05),与TG、TC、LDL-C和FPG 呈负相关(r=-0.545、-0.735、-0.831、-0.565,P<0.05),与BMI、HDL-C和HbA1c无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 血浆miR-146a、miR-223与T2DM患者临床指标相关性分析

2.4血浆miR-146a及miR-223的ROC曲线分析 为评估患者血浆miR-146a及miR-223对T2DM患者的诊断价值,对其血浆miR-146a及miR-223表达量进行ROC曲线分析,结果见表4。血浆miR-146a cutoff值为5.85×109时,诊断灵敏度为72.5%,特异度为73.3%;血浆miR-223 cutoff值为9.26×107时,诊断灵敏度为70.0%,特异度为80.0%;血浆miR-146a联合miR-223检测诊断灵敏度和特异度分别为85.8%、83.3%,见图1。

图1 血浆miR-146a、miR-223 ROC曲线

表4 T2DM患者血浆miR-146a、miR-223的ROC曲线分析

3 讨 论

T2DM是一组以胰岛β细胞功能衰退和胰岛素抵抗为主要病理生理特征的高血糖代谢综合征。在T2DM发病过程中可出现miRNA的表达失调,异常表达的miRNA通过影响患者机体对胰岛素的敏感性、胰岛素的产生与分泌、胰岛β细胞的发育和胰岛素信号传导途径,继而改变葡萄糖代谢过程,导致机体产生胰岛素抵抗和T2DM的发生、发展[2,9]。同时T2DM 的发病与机体炎症因子的异常表达密切相关,不同的炎症因子能够通过多条信号通路诱导胰岛细胞结构与功能的变化,促进机体胰岛素抵抗,进而诱导T2DM的发病[10]。

miR-146a通过Toll样受体信号和细胞因子反应来调节先天性免疫反应,与诸多慢性炎症性疾病密切相关[11]。各种导致核因子-κB(NF-κB)活化的途径均可引起胰岛β细胞凋亡,而miR-146a对炎症因子的转录调控依赖于NF-κB的活化,因而可推测miR-146a参与胰岛β细胞凋亡[12-13]。ROGGLI等[14]对炎症介导的胰岛β细胞凋亡过程中miRNA进行研究发现,miR-146a在胰岛组织中的表达水平上升,因此miR-146a与胰岛β细胞的凋亡关系密切。胰岛素抵抗是T2DM发病的基础病理机制,研究表明,白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等多种细胞因子参与了T2DM慢性炎症过程,使外周胰岛素靶器官对胰岛素的敏感性下降,产生胰岛素抵抗[15]。慢性炎症反应激活Toll样受体信号通路可导致miR-146a的表达上调,上调的miR-146a又可以通过抑制IRAKl和TRAF6来调控多种炎症因子引起的胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足,从而通过负反馈调节通路影响糖尿病的发生和发展[16]。本研究数据显示,血浆miR-146a在T2DM患者中的表达量高于健康人群。

既往研究显示,miR-223与糖尿病的发生、发展及炎症因子的表达有着密切联系。miR-223靶基因主要存在于胞浆和核浆中,可以参与细胞对胰岛素刺激的反应,miR-223可通过PRKACB调控胰岛素分泌[17]。miR-223的表达和炎症因子的表达呈负相关,miR-223 表达的下调能够激活NF-κB信号通路,促进炎症因子的表达,形成慢性炎症反应,引起胰岛素抵抗和胰岛素分泌。ZAMPETAKI等[18]研究发现,在T2DM患者中miR-223的表达水平降低,徐菁等[19]研究发现在肥胖与妊娠糖尿病孕妇外周血中miR-223与miR-155的表达水平显著降低。LU等[20]研究表明,miR-223在T2DM患者血清中的表达显著降低,其在心肌细胞与脂肪细胞中可以靶向调控通过葡萄糖转运体4(GLUT4)调节心肌细胞葡萄糖的代谢。本组研究数据显示,血浆miR-223在T2DM患者中的表达量显著低于对照组,与上述报道数据一致。

对于T2DM患者,血脂、血糖的异常在疾病的发生、发展过程中发挥着重要的致病作用。有研究表明,HbA1c水平越高,受检者静脉血FPG、TG、TC、LDL-C水平也会更高,HDL-C则更低,这主要是由于HbA1c是红细胞中血红蛋白与血清中糖类相结合所得的产物,若受检者长期处于血糖较高状态,则会导致HbA1c的生成,致其糖化水平显著上升[21]。同时,由于胰岛素对TG与糖间的转变有抑制、促进作用,因而若胰岛素分泌过少或生理功能受损,则会影响TG转变为葡萄糖,同时人体内葡萄糖含量、血糖检测值过高,则同样会抑制TG的转变,进而导致受检者出现TG、TC、LDL-C水平升高,HDL-C水平下降等症状。对本研究检测数据进行相关性分析显示,血浆miR-146a的表达水平与患者的病程及患者TG、TC、LDL-C和FPG的表达水平呈正相关,与BMI、HDL-C和HbA1c的表达无相关性。血浆miR-223的表达水平与患者病程呈正相关,与患者血浆TG、TC、LDL-C和FPG的表达水平呈负相关,与BMI、HDL-C和HbA1c无相关性。提示患者血浆miR-146a、miR-223参与T2DM的发病进程。

同时,本组研究还发现,血浆miR-146a和miR-223在T2DM的诊断中具有高灵敏度和特异度。血浆miR-146a诊断AUC为0.792,当诊断临界值为5.85×109时其诊断灵敏度和特异度分别为72.5%和73.3%。血浆miR-223诊断AUC为0.832,当诊断临界值为9.26×107时其诊断灵敏度和特异度分别为70.0%和80.0%;联合检测诊断AUC为0.917,其诊断灵敏度和特异度分别为85.8%和83.3%,以上结果表明血浆miR-146a和miR-223的表达水平可以作为T2DM临床诊断的潜在生物学标志物,但是因为本研究样本检测的数量限制和地域性限制,还需要对上述结果进一步进行大样本量的验证。总之,本研究数据表明,T2DM患者血浆miR-146a和miR-223表达存在显著差异,可以作为临床诊断T2DM的一种新的潜在生物学标志物。