循环肿瘤细胞在胃癌中应用的研究进展

王刘星，王黔，2

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。据估计，2020年全球约有1 930万新发癌症病例和近1 000万癌症死亡病例。其中胃癌占新发病例的5.6%。占死亡病例的7.7%［1］。而在我国，胃癌的发病率和病死率分别位于所有恶性肿瘤的第二位及第三位，远高于世界平均水平［2］。近年来，新辅助治疗、靶向治疗、免疫治疗等［3-5］新方式的出现，改善了部分胃癌病人的预后，但胃癌5年生存率仍然低下，其中最主要的原因是我国大多数病人确诊时已是晚期［6］。所以，寻找一种能大规模筛查、诊断胃癌以及动态监测胃癌治疗敏感性的方法尤为重要。

液体活检是近年来癌症研究领域的热点之一，液体活检是一种强大的技术，可应用于癌症筛查和治疗的不同阶段。在无症状人群中，可用于识别癌症病人，以提高早期诊断和更好地干预，同时可提供胃癌病人动态发展信息及治疗敏感性［7］。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）检测作为液体活检最主要的组成之一，是推动精准医学的重要技术。与普通侵入式的组织活检及细胞学检查相比，CTC检测具有一系列的优势，如标本获取容易、可反复检测等。同时，与另一种液体活检方式——循环肿瘤核酸（circulating tumor DNA，ctDNA）检测相比，CTC作为完整的肿瘤细胞，能够提供肿瘤的基因组、转录组、蛋白质组及代谢组等多种信息［8］。同时可以在体外进行肿瘤细胞的分析［9］。故本研究搜集近几年的相关文献，就CTC在胃癌临床应用中的相关研究进展作一综述。

1 CTC及其检测

CTC最早由澳大利亚病理学家Ashworth［10］于1869年发现，从原发肿瘤或相应的远处转移部位释放到循环血液中的肿瘤细胞统称为CTC［11］。大部分在短期内即发生凋亡或被吞噬，其中的一小部分，称为播散性肿瘤细胞，到达远处的器官，在那里它们可以作为休眠的单个肿瘤细胞或形成临床前期的微转移［12］。同时，存活下来的极少部分CTC可以相互聚集形成循环肿瘤细胞微栓（circulating tumor microemboli，CTM）［13］。最近的研究表明，CTM可能不仅仅是CTC的聚集物，而是与单一的CTM相比，包含CTM的细胞表现出独特的表型和分子特征［14］。此外，在许多病例中，与单个CTC相比，CTM表现出更高的转移潜能和对凋亡抵抗，转移风险是单个CTC的23～50 倍［14-15］。

肿瘤的进展与上皮-间质转换（EMT）有关。EMT可能参与了癌症干细胞的形成，免疫监督的逃逸，以及化疗和靶向治疗耐药机制的产生。CTC代表了癌症播散的第一个关键环节，而CTC也在EMT的幅度上表现出了一定程度的表型异质性。CTC上皮标志物表达在EMT过程中会发生下调，甚至消失，根据EMT标志物的表达可将CTC分为上皮型［表达上皮钙黏素、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、细胞角蛋白（cytokeratin，CK）等］、间质型CTC（表达神经钙黏素、波形蛋白、snail蛋白等）、混合型CTC（同时表达上皮和间质标志物）［8］。而混合型CTC根据上皮标志物和间质标志物的比例又可以分为3类（上皮标志物＞间质标志物、上皮标志物=间质标志物、上皮标志物＜间质标志物）。CTC不同的EMT表型代表了肿瘤进展的不同阶段［16］。肿瘤细胞播散的上皮-间质/间质-上皮假说很好的解释了这一点，一些肿瘤细胞通过EMT过程来逐渐与周围肿瘤细胞分层，分层的肿瘤细胞随着血液循环，侵入到间质之中，再通过MET过程使这些肿瘤细胞重新生长，形成转移灶［17］。大量研究［18］支持了这一观点，同时也发现间质型CTC以及间质标志物占主导的混合型CTC提示肿瘤病人不良的预后，通过动态监测CTC的EMT表型可反映治疗的敏感性。

CTC早在1869年就被首次报道，但对于CTC的研究却停滞了一百多年。主要是因为CTC，特别是CTM在外周血中的含量仅1～1 000个细胞/10毫升［19］，同时缺乏分离它们的技术。直到2004年，随着CellSearch©的出现，这一点成为可能，这是一个专门用于血液样本中CTC计数的工具。该技术是基于用抗EpCAM、各种细胞角蛋白和CD45的抗体标记血液有核细胞。它是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的作为临床CTC检测的唯一技术。然而这种技术也存在一定缺陷，并不是所有的CTC都表达这些标志物，这也是CTC在临床应用中的最大阻碍。其他的一些检测手段通过利用CTC的大小、密度及电荷特性等独特的物理特性。对于CTC的检测，人们不仅仅满足于CTC计数，CTC的EMT表型及分子分型更加受到科学家们的重视。CTC分子分型目前主要包括基于定量PCR（qPCR）、反转录（RT）-qPCR及多重RT-qPCR的方法，基于影像学的方法及微滤器和微芯片设备等［20］。然而不管是计数检测方法还是分子分型检测方法，因其检测手段的差异性，其结果不尽相同，因此，寻求一种高特异性及敏感性的检测手段仍是科学家们的不懈追求。

2 CTC与胃癌

2.1 CTC在胃癌诊断中的应用 胃癌给我国造成了巨大的社会和经济负担。当前，我国胃癌的早期诊断率不足10%。胃镜+组织病理活检是诊断胃癌的“金标准”，由于其有创性，不适合大规模用于疾病的筛查。目前，临床中用于胃癌早期检测的最常见的肿瘤标志物包括癌胚抗原、碳水化合物抗原（CA）-CA199、CA724、CA125、CA242以及甲胎蛋白［21-22］。然而，这些血清生物标志物的特异性和敏感性较差，现有的用于胃癌诊断和预后的循环生物标志物的敏感性和特异性较低，而胃癌的诊断标准仅基于胃镜等侵入性操作。人们急迫需要一种更简单而无创的检测，但也需要高度特异性的生物标志物。

Lee等［23］的研究结果显示，超过80%的早期胃癌病人中检测到CTC，当确定每7.5毫升外周血中CTC计数≥2为CTC阳性，区分胃癌病人与对照组的特异度和灵敏度分别为90.3%［95%CI：（75.6%，97.4%）］和85.3%［95%CI：（81.4%，87.2%）］。而癌胚抗原及糖类抗原（CA）-199等传统肿瘤标志物在胃癌中的阳性率不足40%。另外，也有多项研究报道，在＜1 mm肿瘤的病人外周血中就能检出CTC［24-25］。而通常的影像学检查大多仅能检出1 cm的肿瘤，对早期胃癌的诊断率不足50%。所有这些结果都提示CTC在胃癌早期诊断中的巨大潜力。然而，另有荟萃分析得出，对各种CTC检测方法的诊断准确性分析，CTC对胃癌的综合灵敏度和特异度分别为42%［95%CI：（21%，67%）］和99%［95%CI：（96%，100%）］［26］。CTC对胃癌的敏感性较低，文献产生这些差异可能归因于人群选择、地域差异、标本选择以及CTC检测方法的不同，因此，急迫需要大样本、多中心的高质量研究来证实CTC在胃癌早期诊断中的价值。CTC检测技术的发展也有望解决这一问题。目前，仍需要加强公众的防癌意识来进一步提高我国的早期胃癌诊断率。

2.2 CTC在胃癌治疗中的动态监测 胃癌的治疗是以手术为主的综合治疗。单纯一种治疗手段都难以有良好的治疗效果。目前监测胃癌治疗后有效或疾病进展的主要手段为影像学检查，但影像学检查对胃癌的监测具有滞后性及不准确性，如原发肿瘤体积发生了改变才能识别，无法辨识8 mm以下的小淋巴结转移及对腹膜转移的发现难度较大等［27］。寻求一种合适的评估胃癌治疗敏感性、动态监测胃癌治疗后的疾病转归的方法，对于病人治疗后疾病出现进展的早发现、早治疗具有深远意义［28］。

一项荟萃分析显示，CTC低的结直肠癌病人的疾病控制率显著高于CTC高的病人［RR=1.354，95%CI：（1.002，1.830），P=0.048］，CTC低的病人往往有良好的化疗反应率［29］。Zhu等［30］研究发现，治疗前后CTC阳性和CTC阴性之间差异有统计学意义（中位生存期12.6个月比31.6个月，P＜0.001；中位生存期12.4个月比24.2个月，P=0.002）。两个疗程化疗后，进展组（P=0.002）CTC数量明显增加，而非进展组CTC数量明显减少（P=0.020）。因此，CTC计数的变化与治疗反应（P=0.004）密切相关。这些研究提示在胃癌、结直肠癌病人的治疗过程中，治疗后CTC计数增加往往提示效果欠佳，同时预示着不良预后。根据间质型CTC来实时监测治疗疗效可能更加准确。然而，有文献报道，在接受治疗的胃癌病人中，有部分病人CTC数量呈现增多趋势，但间质型CTC却呈现减少的趋势，最终病人临床缓解，而另一部分病人治疗后CTC数量减少，但间质型CTC却增多，最终这部分病人出现临床进展［31］。在治疗疗效评估上，CTC检测特别是间质型CTC的数量变化可能比影像学检查更早提示治疗疗效，进行实时评估［32］。

胃癌与结直肠癌同属消化道实体肿瘤，具有一定的相似性。通过CTC数量及其表型数量的变化来动态监测胃癌治疗疗效仍需更多的高质量的研究来证实。综合上述研究提示，在肿瘤的化疗过程中，CTC数量增加特别是间质型CTC数量的上升表明了一般的化疗耐药性，而早期转向替代化疗方案一般是没有价值的。在一个周期化疗后发现有CTC，特别是间质型CTC数量增加的病人应该强烈考虑在进展时更换治疗方案。

2.3 CTC指导胃癌的个体化治疗 CTC检测技术是精准医学的重要组成部分之一。如前所述，CTC是一个完整的肿瘤细胞，反映了肿瘤的异质性，可以用来研究和靶向原发性和/或转移性肿瘤的进化突变情况［33-35］。活的CTC可获得肿瘤的遗传和表观遗传特性。此外，培养中的CTC可能有助于筛选敏感的药物，并在新兴的精准医疗和靶向治疗方案中做出重要的治疗决策。目前，CTC的特征已经在不同的肿瘤类型上进行，这并不限于乳腺癌、前列腺癌，还包括胃癌。例如，人类表皮生长因子受体2（HER2）的扩增是20%胃癌的主要原因。它被认为是转移性胃癌病人的生物标志物之一。HER2状态过表达的病人通常接受HER2靶向治疗［36-37］。

Daisuke等［38］共纳入105例转移性或复发性胃癌病人，所有病人均采用CellSearch系统检测CTC中HER2的表达情况。105例病人中有65例（61.9%）检测到CTC，共分为三组：A组，组织学HER2阳性；B组，组织学HER2阴性和CTC上HER2阳性；C组，组织学和CTC上HER2阴性。病人接受卡培他滨+顺铂治疗。A组和B组另外给予曲妥珠单抗治疗。在HER2的表达中，肿瘤组织与CTC无相关性。即使B组没有组织学HER2表达，B组显示良好的预后与A组一样，C组的总体生存率明显低于A组和B组。多变量分析表明，CTC表达HER2是整体和无进展生存时间的一个独立预后因素。该研究显示，曲妥珠单抗联合化疗在CTC上HER2阳性病人中具有潜在的临床应用价值，即使在组织学上是HER2阴性的。在胃癌病人中，Li等［39］报道了组织学HER2阳性和HER2阴性原发肿瘤病人中外周血CTC HER2阳性发生率分别为91.0%和76.2%。上述这些结果提示原发肿瘤与外周血中CTC存在异质性。因此，胃癌组织学HER2阴性的病人须进一步检测外周血中CTC HER2表达情况，综合两者HER2表达情况，选择使用曲妥珠单抗进行HER2靶向治疗。另外，随着CheckMate 649研究结果的公布［40］，免疫治疗被提上进展期胃癌的一线治疗，选择免疫治疗的优势人群也是目前的研究热点。程序性死亡受体配体1、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定、肿瘤浸润淋巴细胞及调节性T细胞等是目前免疫治疗的常用生物标志物［41］。通过CTC来进行这些生物标志物的检测可能也是未来研究的一个方向。从而进行靶向、免疫的个体化治疗。

2.4 CTC在判断胃癌预后中的作用 复发和转移是导致胃癌术后低生存率的主要原因［42］，寻找判断预后的预测因子，评估胃癌病人的预后极为重要。CTC与胃癌的复发和转移密切相关，有潜力作为判断胃癌病人生存期的生物标志物。Ito等［43］在胃癌术前进行CTC检测，得出CTC计数5个以上的病人无复发生存期显著低于CTC计数5个或以下的病人（P=0.034）。Uenosono等［44］研究多变量分析显示CTC是进展期胃癌病人总生存期的独立预后因子（P=0.024）。这些研究显示CTC可以用来判断胃癌病人的预后。如前所述，上皮-间质/间质-上皮在CTC的远处转移中具有十分重要的意义，在Ito等［43］的研究中，外周血中CTC计数5个以上的病人与CTC计数5个或5个以下的病人的总生存期差异无统计学意义（P=0.183）。提示CTC总的计数尚不能精准地判断胃癌病人的预后，Satelli等［45］认为，间质型CTC计数似乎是转移性乳腺癌预后的一个强有力和可靠的预测因子。因而，结合CTC总的计数及间质型CTC计数来综合判断胃癌病人的预后是一个不错的选择，治疗前CTC计数高且间质型CTC阳性预示着不良预后。

除CTC外，CTM也可用于辅助判定胃癌病人的预后。Chen等［46］研究显示，治疗前CTM阳性（≥1 CTMs/6 mL）与肝转移的发生相关。进一步了解CTM的大小的异质性表明，具有不同簇大小的CTM可能对胃癌的预后有不同的贡献。CTM2是胃癌-CTM的主要亚型，而CTM3-4是特异性亚型，与较低的无进展生存期和总生存期显著相关。但CTM在胃癌病人外周血中的检出十分稀少，且胃癌病人在检出CTM时大多已是Ⅳ期［47］，故CTM用于判断胃癌预后的实际意义有限，需要更加先进的CTC检测技术来提高CTM的检出率。

3 总结与展望

CTC具有无创性、可重复检测、可提供肿瘤多组学信息等优点。已有多项研究数据显示，CTC在胃癌的早期诊断、治疗过程中的动态监测、预后的判断及个体化治疗中显示出了巨大的优势。然而，尽管用于分离和分析CTC的技术在过去十多年中得到了飞速发展，但被广泛认可的技术却很少，目前，迫切需要开发一种统一、标准化和自动化的方法来检测CTC及其分子和遗传学分析。

需要进行更多的基础研究来提供更多关于CTC的生物学信息来确定对恶性肿瘤的增殖和转移的重要机制。此外，这些研究有望通过揭示与胃癌病人的药物敏感性和耐药性相关的分子生物学靶点，在精准医学中发挥重要作用。同时，也需要大量多中心、大样本、多种族的临床研究来为CTC在胃癌中的规范应用提供更多的循证学依据。