慢加急性肝衰竭病人免疫功能障碍的机制研究进展

李奕东，刘甜，姚佳，杜旭芳

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指各种急性损伤因素作用下，肝功能相对稳定的慢性肝病病人迅速恶化的肝衰竭综合征［1］。常见的急性诱因包括乙醇、药物、病毒性或细菌感染等。多种因素刺激下先天免疫系统激活引发炎症细胞因子级联反应，诱发过度炎症反应，机体处于全身炎症反应综合征（SIRS）状态。随着病情发展，这种高炎症状态最终破坏了宿主免疫细胞的防御机制导致免疫麻痹，使ACLF病人更容易出现继发感染。继发感染是ACLF病人出现器官功能衰竭和高死亡率的主要原因［2］。因此，深入了解肝衰竭病人免疫功能障碍的发生发展机制，可为ACLF防治提供新的理论基础和依据。本研究通过临床和基础研究从先天性免疫和获得性免疫两个方面阐述ACLF免疫障碍机制、监测评估以及免疫增强的药物治疗，旨在更深入地认识ACLF的免疫功能障碍状态及其临床意义。

1 ACLF先天性免疫功能障碍

先天性免疫是感染后第一道防线，对各种入侵的病原微生物反应迅速。单核/巨噬细胞、树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK细胞）、自然杀伤T细胞（NKT细胞）都是其组成部分［3］。这些细胞杀伤、吞噬病原体，随着疾病持续，促炎反应逐渐向抗炎反应倾斜，最终抗炎反应占主导地位，各种免疫细胞被消耗或处于功能耗竭状态，其在数量、功能、表达状态等方面均发生相应改变。

1.1 单核/巨噬细胞 Kuffer细胞是肝脏原居的巨噬细胞，ACLF发病初，细菌和病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）从肠道中“溢出”，受损的肝细胞持续释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMPs），Kuffer细胞表面受体识别PAMPs和DAMPs而广泛活化，启动促炎反应，分泌促炎因子，介导肝损伤［3］。被激活的外周血单核细胞向肝脏组织聚集，同时骨髓来源的循环单核细胞被激活，产生的细胞因子及趋化因子释放到体循环会引发SIRS。然而，长期暴露于抗原和炎症信号中，单核/巨噬细胞防御机制被破坏，对抗原刺激反应不充分，抗菌功能受损，逐渐出现类似于脓毒症的免疫麻痹现象［3］。

近年来，关于ACLF中单核/巨噬细胞免疫功能障碍的研究逐步增多。外周血单核细胞、Kuffer细胞、模式识别受体及其补体系统在数量上缺失，通过调节核因子κB，外周血中单核细胞表面人类白细胞DR位点抗原（human leukocyte antigen DR，HLADR）表达减少，先天免疫功能下降。然而，骨髓来源的单核抑制细胞数量不降反增［1］。反复Toll样受体（TLR）-2和TLR-4刺激下，循环中具有免疫抑制作用的髓源单核抑制细胞（CD14+HLA-DR-Myeloid-derived suppressor cells， CD14+HLA-DR-M-MDSCs）数量增加［4］，其可抑制T细胞的增殖，损害先天性和适应性免疫，运用TLR-3激动剂可使M-MDSCs扩增并恢复先天免疫功能。

除了各种先天免疫细胞数量上的改变外，Kuffer细胞表型及分泌功能发生转变，主要表现为具有抗炎特性的M2表型，释放一些抗炎因子，如：白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-13、转化生长因子β（TGF-β），发挥免疫抑制作用，IL-10的升高提示肝衰竭预后不良［5］。

此外，单核/巨噬细胞表面受体表达的改变，对获得性免疫细胞的启动及效应产生抑制作用。免疫抑制状态下的单核/巨噬细胞表达CD163清道夫受体，抑制T细胞活化增殖，可溶性CD163具有类细胞因子功能，直接抑制辅助性T淋巴细胞，表现抗炎特性，表达水平越高预示预后越差［6］。另外，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂介导外周血单核细胞膜上Mer受体酪氨酸激酶（Mer receptor tyrosine kinase，MERTK）表达增加，也是单核/巨噬细胞功能受损的一种重要机制，应用MERTK抑制剂可恢复促炎因子的产生，并可能恢复病人的先天免疫应答［7］，成为晚期ACLF病人免疫抑制状态的潜在治疗靶点，有待临床进一步研究。

单核/巨噬细胞在转录代谢水平上也会受到影响。ACLF中分离的CD14+CD16-循环单核细胞的转录分析显示，一系列免疫抑制参数上调，如：糖酵解途径中的谷氨酰胺合成代谢（glutamine anabolism，GLUL），抗菌和抗原递呈机制受损，单核细胞的吞噬反应和代谢过程均变得迟钝。通过抑制GLUL，M2型单核/巨噬细胞可转变为M1表型，发挥促炎作用，抵抗机体免疫抑制［8］。因此，使用谷氨酰胺合成酶抑制剂对细胞进行代谢重组，可以部分恢复单核/巨噬细胞吞噬和促炎能力，改善病人免疫抑制状态，为这些病人的靶向治疗提供了新的选择。

针对ACLF免疫抑制的治疗，补充人体血清白蛋白也起到重要作用，低蛋白血症病人机体免疫麻痹状态严重，感染风险增高，提高人血白蛋白浓度可改善血浆前列腺素（prostaglandin，PG）E2介导的免疫抑制［9］。因此，免疫障碍下的ACLF病人可考虑应用。

1.2 DC DCs是主要的抗原呈递细胞，主要存在于肝脏组织中，分为髓样DC和浆性DC两种。随着疾病持续，循环中DCs大量凋亡致数量减少，其细胞表面程序性细胞死亡蛋白-1配体表达增加，同时产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-12的能力受损［10］，DC的这种功能损伤可能介导宿主特异性T细胞免疫应答抑制。上述研究主要以循环DCs为主要研究对象，对肝脏DCs的组成及功能研究较少。然而，有人发现乙肝相关ACLF病人肝脏组织中，髓样DC和浆性DC大量积累并被激活，分泌IL-10、TGF-β水平上升，同时伴随调节性T细胞（Treg细胞）数增多，起到局灶免疫抑制作用［11］。粒细胞刺激因子通过动员DC和T淋巴细胞进入肝脏， 减轻γ干扰素诱导的肝损伤，以此恢复ACLF病人的免疫功能障碍。

1.3 NK/NKT细胞 NK/NKT细胞是一种具有免疫调节特性和细胞毒性的免疫细胞，与自身免疫性疾病、肝炎和纤维化等多种肝病的肝损害有关［12］。其中NKT是一种特殊的T细胞亚群，细胞表面同时具有T细胞受体（TCR）和NK细胞受体。NK/NKT二者在ACLF的发病机制中也起着关键作用。Liu等［13］针对ACLF、慢性乙型肝炎（CHB）及健康者外周血NK细胞数量进行相关研究，发现ACLF（16.64±12.32）和CHB（19.16±9.65）病人外周血NK细胞数量百分比较健康个体（21.35±8.81）降低。有人还发现相比健康对照组，肝衰竭病人脾脏（4.32%比5.72%，1.68×105比6.01×105）和骨髓中（0.74%比2.27%，7.40×104比5.68×104）的NK细胞比例和数量也明显减少［14］。另一方面，ACLF病人中，具有细胞毒性CD56dimCD16brightNK细胞减少，而CD56dimCD16-、CD56brightCD16-NK细胞增加，NK细胞毒亚群的变化也会导致细胞毒性功能的降低，杀伤作用减弱［13］。NK/NKT在分泌功能上也受到了影响，体内高水平的抑炎因子IL-10抑制NK/NKT细胞分泌γ干扰素和TNF-α的产生［13，15］。同时NK细胞上表达多种激活性和抑制性受体，具体表现为NKG2D分子、NK细胞蛋白（NKp）30、NKp44、NKp46激活受体升高，CD158a抑制受体增加，而CD158b抑制受体减少［13］。而NKT细胞表面高表达T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（TIM3）免疫抑制受体［16］。以上描述证明NK/NKT细胞受体的异常表达与ACLF病人先天免疫反应受损存在关联。不仅如此，抑制NK细胞中钾离子通道相关基因的表达，封锁钠离子和钾离子通道抑制T细胞激活，削弱NK细胞活化［12，17］。总之，NK/NKT细胞数量的减少、细胞毒亚群、表面受体的改变以及相关细胞因子产生减少、相关基因改变可能都会导致细胞毒功能下降，削弱机体对感染的免疫反应，诱导免疫麻痹，导致病情进一步恶化［13］。

2 获得性免疫

肝衰竭的发病过程中免疫介导的肝损伤起主要作用，而T淋巴细胞在清除病毒和坏死肝细胞中起到重要作用。免疫应答异常和免疫失衡是ACLF的重要发病机制之一。随着ACLF进展，获得性免疫功能受损，T细胞功能障碍，T细胞逐渐耗尽，进入一种“衰竭”状态，具体表现为外周血T细胞数量减少、细胞活性降低、增殖分泌功能障碍、T淋巴细胞反应性降低或无反应性［18］。

2.1 CD8+T淋巴细胞 在数量上，ACLF病人中外周血CD8+T淋巴细胞呈进行性下降，尤其是活化的外周血CD8+T淋巴细胞数量明显降低［19］。此外，Wang等［20］针对外周血T淋巴细胞百分比与终末期肝病模型（model for end-stage liver disease， MELD）评分之间关系进行了疾病严重程度及预后分析，研究显示ACLF病人外周血T淋巴细胞比例明显低于健康对照组，提示病人机体此时处于免疫衰竭状态。同时MELD评分与外周血T淋巴细胞百分比存在明显负性相关，治疗前状态下，淋巴细胞百分比越低，MELD评分越高。经4周综合治疗后，T淋巴细胞数量减少趋势较慢，疾病进展缓慢，预后较好。因此，针对外周血T淋巴细胞的免疫治疗也可能为解除ACLF免疫抑制提供可能性。

CD8+T淋巴细胞表面标志物表达改变也是肝衰竭免疫抑制状态的一种特征性表现。ACLF病人中，活性降低的CD8+T淋巴细胞其表面激活标志物（CD69、CD38和穿孔素）表达下降［21］。而在ACLF病人免疫抑制状态下，CD8+T细胞上的共刺激［如CD40L，诱导性共刺激分子（ICOS），OX40，CD69，CD38，CD95，糖皮质类固醇诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR），TIM-1］和抑制性免疫检查点（如PD1，KLRG1，PDPN，PROCR，TIM3，CTLA4，TIGIT）均表达上调［1］。除此之外，NKG2A也是表达于NK细胞和CD8+T淋巴细胞的抑制性受体，在维持这些免疫细胞的功能和稳态中发挥着重要的免疫负调节作用，ACLF病人中，CD8+T细胞上NKG2A表达上调，同时NK细胞上激活性受体NKG2D表达下调， 两种受体之间的失衡可能加速乙型肝炎病毒（HBV）相关ACLF的进展［22］，促进免疫功能障碍。胸腺细胞选择相关高迁移率群盒蛋白通过上调各种抑制受体的表达，诱导CD8+T细胞衰竭和功能失调表型引起免疫功能麻痹［23］。

在功能上，ACLF病人CD8+T淋巴细胞受刺激后的分泌能力明显下降，表现为无法有效产生IL-2，IL-6，IL-8和γ干扰素和TNF-α等促炎性细胞因子［5］。除此之外，其抑炎因子产生增多，如IL-35，IL-10［3］。其中IL-10是一种信号转导及转录活化因子3（STAT-3）诱导细胞因子，可减弱T细胞活化，阻断IL-10产生可以预防并逆转T细胞耗竭［5］。近两年新发现的一种细胞因子IL-35，既可抑制抗原非特异性细胞毒性CD8+T细胞的活性，又可抑制细胞因子介导的靶细胞死亡。IL-35刺激下，ACLF病人外周血CD8+T细胞呈现出耗竭表型，表现为程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）、淋巴细胞活化基因-3上调，穿孔素、颗粒酶B、Fas配体下调，抑制细胞毒性和肿瘤坏死因子-γ的产生。因此，IL-35可能是改善ACLF免疫抑制治疗靶点之一［24］，有待进一步研究。

另外，除了细胞因子参与CD8+T细胞耗竭调控外，其他可溶性介质也参与其中。前列腺素E受体2（prostaglandin E receptor 2，EP2）是一种免疫平衡调节分子。有学者发现，PGE2具有免疫抑制作用，ACLF病人CD8+T细胞表面EP2表达降低，PGE2水平显著升高［9］，使机体处于免疫低反应状态，与继发感染易感性相关［25］。不仅如此，EP2也在先天免疫反应中发挥抑制作用，EP2选择性激动剂可减少外周血单个核细胞中促炎细胞因子产生。因此，PGE2及EP2的改变可抑制ACLF病人先天性和适应性免疫细胞对LPS或大肠杆菌的过度炎症反应［9］。输注白蛋白治疗后，将人血白蛋白水平升高至30 g/L以上，通过结合和灭活PGE2逆转了免疫功能障碍［26］。EP2可能成为治疗ACLF免疫抑制的新潜在靶标。

以上，从细胞计数、分泌功能、表面标志物表达情况及血清中其他可溶性介质含量等方面综述了免疫失调过程中CD8+T淋巴细胞免疫状态，提示CD8+T淋巴细胞参与了ACLF的免疫抑制过程。

2.2 CD4+T淋巴细胞（调节性T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞） Treg和辅助性T淋巴细胞17（helper T cell 17，Th17）具有共同的起源，都来源于初始T细胞。IL-6可以决定初始T淋巴细胞分化途径的方向，当IL-6不存在时分化趋向具有免疫抑制作用的Treg子集；在IL-6存在的情况下分化趋向介导炎性反应的Th17子集，两种细胞作用相反，在分化过程中存在一定的竞争关系并处于动态平衡中［27］。肝衰竭进展晚期，Th17细胞数量降低，促炎细胞因子减少，促炎功能减弱，同时发挥免疫抑制作用的Treg细胞数量上升明显［27］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂作为负调控因子可抑制IL-6/STAT3信号通路［28］，在ACLF过程中表达上调，促进CD4+CD2 5+Treg的增殖，抑制Th17的增长，这说明了Th17细胞与CD4+CD25+Treg细胞之间存在免疫失衡，二者动态变化共同介导肝衰竭免疫麻痹［29］。通过恢复Th17/Treg免疫平衡，可以阻止本病的进展［27］。

除了数量上的变化，Treg细胞还可通过表面标志物改变以及分泌功能障碍来发挥免疫抑制作用。细胞高表达CTLA-4和PD-1，通过传递抑制信号而抑制效应T细胞的活化［30］，还可抑制DC活化以及影响细胞因子分泌，如IL-10产生增多。表达不同的表面分子的Treg细胞亚群，其作用也不尽相同。研究发现，CTLA-4、HLA-DR、CD45RO、Ki-67等表面标志物在CD39+FoxP3+Treg细胞的表达明显高于CD39-FoxP3+Treg，表达CD39+的Treg细胞抑制细胞增殖功能明显增强，且能明显抑制外周血单个核细胞γ干扰素的分泌，介导肝衰竭免疫麻痹［29］。

2.3 黏膜相关恒定T 细胞（MAIT） MAIT是对细菌产生免疫应答的丰富T细胞亚群，其特征是含有不变TCR链，表现为天然杀伤细胞标志物CD161的高表达。在肝功能衰竭的中晚期，可能由于长期的慢性进程，循环中MAIT细胞逐渐衰竭，数量减少，机体免疫反应功能失调，进入免疫抑制状态。病毒持续存在，病情加重，机会性感染的风险增加都是可能造成的严重后果。经治疗后，肝衰竭改善状态下，循环MAIT细胞的数量可部分恢复，表明循环MAIT细胞是预测HBV相关肝衰竭预后的主要标志物，死亡病人的MAIT细胞较存活病人明显减少，且MAIT细胞的数量越高，病人存活率越高。因此，恢复MAIT细胞数量可能成为治疗肝衰竭免疫抑制的良好手段［31］。

3 总结

总之，晚期ACLF病人体内存在严重的免疫问题，代偿性抗炎反应缺陷，固有和适应性免疫衰竭和失调，随之而来的功能性免疫瘫痪，多种免疫细胞在数量、增殖活性以及分泌能力上都受到了影响。然而，严重的免疫紊乱在ACLF独特的发病机制中起着关键作用，可导致器官衰竭、更高的感染风险和ACLF进一步进展。因此，防止这些免疫紊乱的发展是ACLF新的治疗策略。