改良豆粕对婺农土鸡骨骼代谢及肠道酶活性的影响

朱单瓅, 张晓菲, 肖佳敏, 李春俣, 白晓文, 陆锦灏, 李珍妮, 朱怡杰, 岑 锎, 刘宏缘, 刘 鹏

(1.金华职业技术学院 农学院, 浙江 金华 321017; 2.浙江师范大学 植物学实验室, 浙江 金华 321004)

0 引言

【研究意义】土鸡是本地鸡的代称,常放养于山野林间并辅以粗饲料喂养,具有绿色无公害的特质,颇受消费者青睐。但由于土鸡养殖缺乏饲料营养配比标准及饲养管理不健全等问题,其营养性与适口性不尽人意。大豆异黄酮(SI)是豆科植物产生的多酚类化合物,具有促生长、增强免疫力以及提高蛋白质合成效率等多种功能,将其添加于饲料中能够有效提高禽畜的生产及生理性能[1]。豆粕是传统鸡饲料中的重要组成部分,其中的结合型大豆异黄酮(SI)需要被水解为苷元才能发挥效用[2]。β-葡萄糖苷酶可将豆粕中的结合型大豆异黄酮水解成游离型苷元[3]。探究改良豆粕对婺农土鸡骨骼代谢及肠道酶活的影响,对婺农土鸡的产业化发展具有重要意义。【前人研究进展】刘敏燕[4]研究发现,在三黄鸡的日粮中添加不同水平的维生素E能有效提高其生产性能并改善肉质,还可提高α-生育酚含量并调控脂质代谢的相关基因。赵英虎等[5]研究表明,添加0.2%的复合镁制剂可有效提升肉鸡的饲料利用率,并显著提升饲料的转化率。QIAN等[6]研究表明,β-葡萄糖苷酶能促进消化,蛋白质在总消化道中的表观消化率显著提高9.02%,脂肪在总消化道中的表观消化率极显著提高7.40%。周振雷等[7]研究发现,将大豆异黄酮添加在日粮中能有效提高蛋鸡产蛋后期的血浆钙和降钙素水平。那晓琳等[8]研究表明,卵巢摘除的患骨质疏松症大鼠在补充大豆异黄酮后,其股骨密度增大。马学会等[9]研究表明,蛋鸡饲料中补加大豆异黄酮,其产蛋后期的蛋壳品质显著提高,血清钙总含量提高,血清碱性磷酸酶活性降低,骨密度增大。钱利纯[10]报道,β-葡萄糖苷酶活性在鸡肠道中的活性变化与肠道内pH差异有关,其小肠内pH为6.0左右时,β-葡萄糖苷酶的活性仅为pH 4.5时的1/3。朱单瓅等[11]研究表明,改良豆粕可改善婺农土鸡机体细胞氧化胁迫,促进其生长发育并提高机体抗氧化能力。【研究切入点】鲜见改良豆粕对婺农土鸡骨骼代谢及肠道酶活性影响的研究报道。【拟解决的关键问题】探明添加β-葡萄糖苷酶水解豆粕按不同比例替换基础日粮(未水解豆粕)对婺农土鸡骨骼代谢及肠道酶活性影响,以期为土鸡功能饲料的开发与应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试鸡 选取生长体型适中及性状优良的婺农土鸡160只,由金华职业技术学院动物养护疾病诊治实训中心提供。

1.1.2 试剂 钙测试盒和无机磷测试盒,以及胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶测试盒,均采购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 160只婺农土鸡随机分为4个组,每个组按不同比例添加β-葡萄糖苷酶水解豆粕替换基础日粮(未水解豆粕)为1个处理,共计4个处理(CK、T1～T3,其中,T1、T2和T3分别在基础日粮中添加 1%、2%和 4%的提取酶液)。CK,基础日粮(即全部未替换);T1,加酶水解豆粕替换1/3基础日粮;T2,加酶水解豆粕替换2/3基础日粮;T3,加酶水解豆粕100%替换基础日粮。每处理4次重复,每次重复10只鸡。试验期5个月,采取网上平养法,自由饮水、采食,定时通风换气。

1.2.2β-葡萄糖苷酶粗酶液的制备 挑取平板培养基上的黑曲霉孢子,将其均匀接种固定在种子培养基瓶中,置于30 ℃、180 r/min 的摇床中进行振荡培养。扩大培养24 h后,吸取1.5 mL培养液-菌液混合物接种于发酵培养基中,摇床振荡培养48 h。用纱布滤去菌体得到发酵液,发酵液在4 ℃、10 000 r/min离心10 min后收集上清液,得到β-葡萄糖苷酶粗酶液,置于4 ℃条件下保存备用。

1.2.3 指标测定

1) 肠道酶活性。参照NY/T 823-2020[12]要求,在饲养结束后,称重并选择CK和生长性能显著优于CK的替换比例处理土鸡屠宰后取肠道(十二指肠、空肠、回肠)内容物样品,进行称量和指标测定。采用p-NPG底物法测定肠道β-葡萄糖苷酶酶活[13-14],考马斯亮蓝法测定反胶束萃取[15]得到β-葡萄糖苷酶酶活[16]。

2) 血清生化指标。采样前鸡空腹12 h,用普通采血管翅静脉采血5 mL,斜置于试管架上,静置30 min,然后在3 000 r/min离心15 min,取上清液1.0～1.5 mL置于离心管中于-20℃保存,用于检测血清生化指标。采用钙测试盒测定土鸡血清钙(Ca)含量和无机磷测试盒测定土鸡血清磷(P)含量[17];采用胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶测试盒测定土鸡十二指肠酶活性[18]。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 22.0的单因素方差分析法和Duncan法计算平均值和标准误,分析显著性差异(α=0.05);采用Origin 8.5制图。

2 结果与分析

2.1 加酶水解豆粕不同比例替换基础日粮婺农土鸡血清的钙(Ca)含量

从图1看出,21 d和42 d时不同处理婺农土鸡血清的钙(Ca)含量均存在差异,42 d时各处理血清Ca含量均高于21 d。21 d:各处理血清Ca含量为2.17～2.29 mmol/L,依次为T1>T2>CK>T3,T1显著高于CK和T3,T3显著低于其余处理。42 d:各处理血清Ca含量为2.42～2.53 mmol/L,依次为T1>T2>T3>CK,CK显著低于T1和T2,T1、T2、T3间差异不显著。总体看,1/3加酶豆粕替换基础日粮对婺农土鸡血清Ca含量促进效果最佳。

2.2 加酶水解豆粕不同比例替换基础日粮婺农土鸡血清的磷(P)含量

从图2看出,21 d和42 d时不同处理婺农土鸡血清的磷(P)含量均存在差异,42 d时各处理血清P含量均低于21 d。21 d:各处理血清P含量为3.24～3.34 mmol/L,依次为CK>T3>T2>T1,各处理间差异不显著。42 d:各处理血清P含量为2.83～2.93 mmol/L,依次为T1>T2>CK>T3,T1显著高于T3,T1、T2、CK间和T2、T3、CK间差异均不显著。总体看,加酶豆粕替换1/3基础日粮对婺农土鸡血清P含量的促进效果最好。

2.3 婺农土鸡不同消化阶段β-葡萄糖苷酶的活性

从图3看出,CK不同阶段β-葡萄糖苷酶的活性为0～187.26 U/mg,十二指肠阶段的酶活性最高,原始饲料酶活性最低;十二指肠的酶活性显著高于其余阶段,饲料原始酶活性显著低于其余阶段,回肠和粪便的酶活性差异不显著,2个阶段的酶活性显著低于空肠。T2不同阶段β-葡萄糖苷酶的活性为445.71～3 060.68 U/mg,十二指肠阶段的酶活性最高,饲料原始酶活性最低;十二指肠的酶活性显著高于其余阶段,饲料、回肠和粪便阶段的酶活性差异不显著,均显著低于空肠。

注:各处理不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

钙(Ca)和磷(P)一般以离子形式存在,血清Ca能有效调节动物的新陈代谢[19],参与维持神经肌肉兴奋性,调节激素分泌及构成骨骼和牙齿。血清P含量反映动物体内骨的代谢状况,因此对其定量测定可直接了解骨骼的生理代谢变化[20]。P参与能量和核酸代谢,有助于维持膜的完整性,对骨骼和牙齿的生成有重要作用。缺乏P时,动物易出现食欲降低,生长减缓,饲料利用效率和产出效率下降的生理变化。通过在饲粮中添加β-葡萄糖苷酶,并借助其高效水解糖苷键的性能,快速分解结合性大豆异黄酮,提高土鸡等动物对大豆异黄酮的利用效率,促进代谢,加速骨骼生长。研究结果表明,21 d和42 d各处理血清Ca含量分别为2.17～2.29 mmol/L和2.42～2.53 mmol/L,依次为T1>T2>CK>T3和T1>T2>T3>CK,42 d时各处理血清Ca含量均高于21 d,21 d时T1显著高于CK和T3,42 d时CK显著低于T1和T2;P含量分别为3.24～3.34 mmol/L和2.83～2.93 mmol/L,依次为CK>T3>T2>T1和T1>T2>CK>T3,42 d时各处理血清P含量均低于21 d,21 d时各处理间差异不显著,42 d时T1显著高于T3;婺农土鸡不同消化阶段β-葡萄糖苷酶的活性,CK和T2分别为0～187.26 U/mg和445.71～3 060.68 U/mg,均以十二指肠的酶活性最高,饲料原始酶活性最低。42 d时各处理血清Ca含量均高于21 d,可能是由于β-葡萄糖苷酶能够催化豆粕中的结合异黄酮分解,促进婺农土鸡吸收饲料中Ca[21]。42 d时各处理血清P含量均低于21 d,是由于在土鸡生长过程中,无机磷盐既会在储能过程中产生高能磷酸化合物,也参与糖代谢途径,通过磷酸化作用生成中间产物,同时由于骨骼的快速生长发育,大量磷元素会以磷酸钙盐的形式聚积在骨骼中[22]。婺农土鸡不同消化阶段以十二指肠的β-葡萄糖苷酶的活性最高,可能是由于β-葡萄糖苷酶能促进消化,提高蛋白质和脂肪在总消化道中的表观消化率[6]。血清Ca和P含量在21 d和42 d时的变化与周振雷等[7]的研究结果相符。β-葡萄糖苷酶通过水解作用将豆粕中的结合态大豆异黄酮转化为游离型苷元,从而有效促进婺农土鸡对豆粕中营养成分的消化吸收;通过激发大豆异黄酮中的雌激素活性,影响内分泌系统,加速婺农土鸡体内睾酮和垂体生长素(GH)释放[23],协助肌蛋白合成,改变脂蛋白比例[24],最终表现为骨骼生长加快。

大豆异黄酮只有在动物雌激素分泌不足时才能发挥促进骨骼代谢作用。该研究选取正常的婺农土鸡,因此提高大豆异黄酮利用率对婺农土鸡骨骼生长的影响不大。此外,低浓度β-葡萄糖苷酶对婺农土鸡的促生长效果显著;进一步提高浓度,反而会引起肉公鸡生长速率的下降,可能是由于高浓度的β-葡萄糖苷酶能大量分解结合型大豆异黄酮,土鸡通过肠道吸收的游离型大豆异黄酮增多,而过量的大豆异黄酮则会对其生长代谢和骨骼发育产生负面影响。同时,肠内容物的小环境较复杂,由于存在多种营养物质,肠道内大豆异黄酮的浓度相对较低,显著影响β-葡萄糖苷酶的降解效率。同时,由于β-葡萄糖苷酶对底物结合部位的专一性不强,肠内容物中存在的其他底物也会对酶与结合型大豆异黄酮的结合产生竞争。因此,随着肠道的蠕动,β-葡萄糖苷酶活性逐渐降低。此外,β-葡萄糖苷酶的酶解作用也会随着肠道蠕动而逐步下降,说明β-葡萄糖苷酶的酶解作用主要发生在十二指肠。

4 结论

β-葡萄糖苷酶水解豆粕不同比例替换基础日粮均能促进婺农土鸡骨骼代谢,替换1/3基础日粮对土鸡生长的促进效果最好,消化过程中β-葡萄糖苷酶在十二指肠的酶活性最高,其酶解作用主要发生在小肠前端。