烤烟-刺梨提取物Maillard反应产物清除烟气中气相自由基的效果

刘文霖, 赵瑞娟, 苏贤坤, 薛小平, 郑晓曼, 耿召良

(1.贵州省烟草科学研究院, 贵州 贵阳 550081; 2.上海烟草集团北京卷烟厂有限公司, 北京 101121; 3.中国烟草总公司 海南省公司, 海南 海口 570106)

0 引言

【研究意义】自由基在生物体内普遍存在,自由基的水平与生物体的代谢活跃程度紧密相关,是人体内氧化反应中产生的化合物,具有强氧化性,可损害肌体组织和细胞,进而引起慢性疾病及衰老效应。卷烟在燃烧过程中产生大量自由基,烟气中的自由基可分成两类,一类为粒相自由基,如醌/半醌自由基、多环芳烃自由基、石墨碳和磷自由基,其分子量较大,稳定性较高;另一类为气相自由基,如烷类自由基、烷氧自由基和氧自由基等,其重量小,稳定性差[1]。目前,自由基对吸烟者健康的影响引起了烟草科技工作者的广泛关注。清除卷烟烟气中自由基的主要方法是向烟丝和滤嘴中加入自由基清除剂[2]。所用的清除剂主要有天然植物类抗氧化剂[3-7]、氨基酸、酶及维生素类[8-10]、微量元素[11]和天然矿物质[12-13]等。刺梨(Rosaroxbunghii)属蔷薇科蔷薇属茨梨的果实,为贵州特色植物资源;无籽刺梨属蔷薇科蔷薇属多年生攀援类果树,为贵州特有品种,富含多糖、维生素C、SOD活性物质和多酚等物质,抗氧化作用显著。对烟草-刺梨提取物为底物的美拉德(Maillard)反应产物清除烟气中气相自由基的效果进行研究,对降低烤烟燃烧过程中的自由基含量以及卷烟提质增香具有重要意义。【前人研究进展】Maillard反应也称羰氨反应,主要指醛、酮、还原糖的羰基与氨基酸、肽、蛋白质等含氮化合物的游离氨基之间发生的一系列反应,因其具有安全和制备简单等特点,其在生物医药、食品等方面广泛应用。王惠英等[14-17]研究表明,Maillard产物除了能补充卷烟的香味外,还具有抗氧化性。Maillard反应中间阶段产物包括还原酮、醛及杂环化合物,终产物为大分子类黑色素和芳香化合物。以烟草提取物为底物的Maillard反应产物能产生与烟草协调的香味,对降刺除杂和改善余味效果明显[18]。何江等[19]研究表明,强化SOD刺梨汁可提高患者机体抗氧化物质的活性和含量;杨江涛等[20]研究刺梨多糖对衰老小鼠体内抗氧化能力的影响表明,刺梨多糖可以剂量依赖性地提高衰老小鼠体内的抗氧化能力;何伟平等[21]以野生刺梨果提取的刺梨粉为对象,研究其清除羟自由基能力的结果表明,刺梨粉对羟自由基的清除作用优于抗坏血酸及其他抗氧化剂,是抗坏血酸的47倍。【研究切入点】刺梨具有清除自由基和保健作用等功能,目前,有关烤烟-刺梨提取物Maillard反应产物清除烟气中气相自由基的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以烤烟提取物和刺梨提取物为反应底物进行Maillard反应,研究Maillard反应产物清除烟气中气相自由基的最佳比例及其对烤烟感官质量的影响,以期为卷烟提质增香提供新的路径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 烤烟和刺梨 供试烤烟品种为云烟87,由遵义产区、毕节产区、黔西南产区提供,选取等级为C3F初烤烟叶,去梗切成宽1 mm烟丝,并卷制成烟支,分别标记为烤烟a、烤烟b和烤烟c;刺梨干果和卷烟(品牌A、品牌B、品牌C)均市购;

1.1.2 试剂 甘氨酸(生物纯)、1,2-丙二醇(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、盐酸(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)、无水乙醇(分析纯)和CCl4(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司;2-苯基叔丁基硝酮(N-t-Butyl-α-phenylnitro,PBN,分析纯)购自阿拉丁;水为去离子水。

1.1.3 仪器设备 X85-2恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司),LR4011/G3旋转蒸发仪(Heidolph),7890A-5975C气质联谱仪(美国安捷伦公司),顺磁共振仪(德国布鲁克的EMX-6/1),吸烟机Omerica ASM20+(欧美利华)。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

1) 烤烟提取物的制备。取等级为C3F的K326烟叶2 kg,去梗切成宽1 mm烟丝,以90%乙醇对烟丝进行加热回流提取3次,合并滤液,回流至无醇味,得到烟草提取物。

2) 刺梨提取物的制备。将刺梨干果置于60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,粉碎,过40目筛,所得粉末用80%乙醇加热回流提取5次,去杂,每次2 h,用漏斗过滤提取液,回流至无醇味,得到刺梨提取物。

3) Maillard反应产物提取。参照刘文霖等[22]方法,将烟草提取物和刺梨提取物按最佳Maillard反应条件(初始pH为7、反应温度为113 ℃、反应时间为5.5 h、物料比为32.6%)提取Maillard反应产物。

1.2.2 试验设计

1) Maillard反应产物不同用量清除初烤烟叶烟气中气相自由基试验。使用微量注射器,将Maillard反应产物分别按烟丝重量的0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、0.70%、1.00%、1.50%注入烟支滤嘴中,3次重复。处理好的烟支置于温度(22±2)℃、湿度(60±2)%的恒温恒湿箱中平衡48 h后待测,确定最佳比例。

2) Maillard反应产物清除卷烟和初烤烟叶烟气中气相自由基试验。确定Maillard反应产物∶烟丝重量的重量比为0.50%,分别将Maillard反应产物按比例均匀添加在卷烟(品牌A、品牌B和品牌C)和初烤烟叶(烤烟a、烤烟b和烤烟c)的烟丝中,3次重复,分别测定处理前和处理后烟气中气相自由基含量。上述处理同样分别添加在对应烟支的滤嘴中,重复3次,分别测定处理前和处理后烟气中气相自由基含量。

3) Maillard反应产物对感官评价的影响试验。将Maillard反应产物按烟丝重量的3‰均匀喷洒到烤烟a中,以未添加Maillard反应产物的烤烟a为对照,将烟支放于温度(22±2)℃、湿度(60±2)%的恒温恒湿箱中平衡48 h后进行感官质量评价。

1.3 指标测定

1.3.1 氮杂环类物质测定 采用7890A-5975C气质联用仪分析氮杂环香气物质。色谱柱为HP-5MS(60 m×250 μm×0.25 μm)毛细管色谱柱,进样量1 μL;进样口温度:280 ℃;分流比:20∶1;柱流速:1.0 mL/min;升温程序:40 ℃保持3 min,然后以6 ℃/min升至280 ℃保持7 min。质谱条件:离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;电离能70 eV;传输线温度280 ℃;全扫描质量数为45～450 aum,溶剂延迟6 min;采集模式为全扫描(Fullscan)与选择离子检测(SIM)同时采集。MS谱库:NIST08库和Willy08库。

1.3.2 气相自由基测定 将气相自由基捕集装置连接吸烟机,捕集液CCl4溶液浓度0.01 mol/L,体积8 mL。捕集前预热15 min,然后将烟支插入吸烟机的烟支夹持器,依据《卷烟 用常规分析用吸烟机测定 总粒相物和焦油》(GB/T 19609—2004)[23]抽吸烟支,每次捕集20支烟,抽吸结束后立即将捕集液转移至10.00 mL冷冻管并置于-80 ℃液氮中保存,备用。捕集液解冻后,参照周骏等[24]的方法,取100 μL到核磁管中,插入顺磁仪进行自由基检测。

1.3.3 感官评价 依据《烟草及烟草制品 感官评价方法》(YC/T 138—1998)[25],由9名专家进行感官评价,评价指标包括香气质、香气量。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2010和SPSS 25.0对试验数据进行统计分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 Maillard反应产物主要氮杂环类物质及其含量

从表1看出,刺梨-烟草提取物Maillard反应产物检测的氮杂环类物质总量为236.68 μg/mL,共有18种。其中,吡啶类氮杂环化合物含量最高,达193.21 μg/mL,具有面包烘烤香味;2-乙基-3-羟基-4-吡喃酮和2-乙酰基噻唑含量较高,分别为35.78 μg/mL和5.65 μg/mL,具有焦糖、果香味和较浓烤香味。表明,刺梨-烟草提取物Maillard反应产物氮杂环类物质种类多,含量高,具有提升香气的作用。

表1 Maillard反应产物的主要氮杂环类物质及其含量

2.2 Maillard反应产物不同用量对初烤烟叶气相自由基的清除效果

由图1可知,随Maillard反应产物添加量增加,烟气中气相自由基清除率大致呈先升后降趋势。当添加量由0.01%增至0.50%时,气相自由基清除率由5.20%升至18.28%,以添加量为0.50%时的气相自由基清除率达最高(18.28%);当添加量由0.50%增至1.00%时,气相自由基清除率由18.28%降至10.88%;当添加量由1.00%增至1.50%时,气相自由基清除率变化不大,基本维持在11.00%。综合初烤烟叶气相自由基的清除效果和成本,Maillard反应产物以添加量0.50%最佳。

图1 Maillard反应产物不同用量清除烟气中气相自由基的清除率

2.3 Maillard反应产物对卷烟及初烤烟叶气相自由基的清除效果

由图2A和图2B可知,将Maillard反应产物对卷烟和初烤烟叶的烟丝和滤嘴气相自由基的清除效果存在差异。烟丝:卷烟品牌A、品牌B、品牌C、烤烟a、烤烟b和烤烟c处理前的气相自由基含量平均值分别为21.95×1014spin/支、10.07×1014spin/支、7.89×1014spin/支、10.26×1014spin/支、8.48×1014spin/支和8.94×1014spin/支,处理后分别为19.74×1014spin/支、9.28×1014spin/支、7.08×1014spin/支、9.39×1014spin/支、7.72×1014spin/支和8.10×1014spin/支。其中,卷烟品牌A、品牌B和品牌C处理后的气相自由基含量均极显著低于处理前,且气相自由基清除率分别为10.07%、7.85%和10.27%。烤烟a和烤烟b处理后的气相自由基含量均极显著低于处理前,烤烟c处理前、后的气相自由基含量差异不显著,其气相自由基清除率分别为8.48%、8.97%和9.39%。滤嘴:卷烟品牌A、品牌B、品牌C、烤烟a、烤烟b和烤烟c处理前的气相自由基含量分别为21.95×1014spin/支、10.07×1014spin/支、7.89×1014spin/支、10.26×1014spin/支、8.48×1014spin/支和8.94×1014spin/支,处理后分别为18.14×1014spin/支、8.71×1014spin/支、6.40×1014spin/支、8.96×1014spin/支、7.01×1014spin/支和7.68×1014spin/支。其中,卷烟品牌A、品牌B和品牌C处理后的气相自由基含量均极显著低于处理前,且气相自由基清除率分别为17.36%、13.51%和18.89%。烤烟a和烤烟b处理后的气相自由基含量均极显著低于处理前,烤烟c处理后的气相自由基含量显著低于处理前,其气相自由基清除率分别为12.67%、17.33%和14.09%。表明,将Maillard反应产物添加在卷烟和初烤烟叶烟丝和滤嘴中,清除烟气中自由基效果明显,且添加在滤嘴的清除效果更好。

注:不同大、小写字母表示差异达极显著(P<0.01)和显著水平(P<0.05),下同。

图2B 卷烟及初烤烟叶滤嘴中气相自由基的含量

2.4 添加Maillard反应产物烤烟a的感官评价

由Maillard反应产物对感官评价的影响试验结果表明,未添加Maillard反应产物(CK)处理烤烟烟香稍单薄,稍有甜感;添加Maillard反应产物后,烤烟的烟香气较丰富,烟香味明显,甜感明显增加,回味较厚重。表明,添加3‰ Maillard反应产物可有效改善烤烟的感官质量。

3 讨论

贵州具有极大的烟草资源优势。无籽刺梨是贵州特有的刺梨资源,因其丰富的营养和抗氧化作用在食品、医药中应用较多。利用贵州丰富的烟草资源和独有的刺梨物种,研究烟草、刺梨提取物美拉德反应的抗氧化作用及其在卷烟中的加香效果,验证了烟草美拉德反应物的抗氧化活性,同时在前人基础上,进一步验证了Maillard产物具有对烟气中气相自由基的清除能力,其中,反应产物添加在烟丝及滤嘴中的清除效果存在差异。刺梨提取物与烟草提取物的美拉德反应产物添加至烟丝中时,在烟丝燃烧过程中,二者反应产物一方面发挥着清除自由基的作用;另一方面,其自身一部分也会在燃烧过程中裂解出自由基,因此,当反应产物添加至烟丝中,最终测定的自由基含量由以上两方面共同作用决定。当添加量在一定范围内,二者反应产物自身裂解产生的自由基较少,以清除自由基为主导,随着添加量不断增加超过一定范围时,自由基降低率反而降低。因此,二者反应产物的添加量应控制在一定的范围内。综合考虑烤烟-刺梨提取物Maillard反应产物清除烟气中气相自由基的成本和清除效果,反应物添加量为0.3%较为适宜。

试验仅研究了烟气中气相自由基的含量变化,以及Maillard反应产物对烟气中自由基的清除作用。目前,尚未见有关侧流烟气自由基的报道,因此,检测侧流烟气和环境中烟气自由基浓度,分析其对吸烟者和周围环境具有现实意义。但当前抗氧化剂的清除效率不高,如何开发出一种既能保持卷烟吸味,又能高效降低烟气中自由基的清除剂是值得深入研究的重要课题,在今后可进一步探究抗氧化剂清除烟气中气相及粒相自由基的机制。

4 结论

刺梨-烟草提取物Maillard反应产物检测的氮杂环类物质总量为236.68 μg/mL,共有18种,以吡啶类氮杂环化合物含量最高,达193.21 μg/mL,具有面包烘烤香味。Maillard反应产物添加量为0.50%时,烟气中气相自由基清除率最高,为18.28%;且添加在卷烟烟丝中,卷烟品牌A、品牌B和品牌C的气相自由基清除率分别为10.07%、7.85%和10.27%,烤烟a、烤烟b和烤烟c分别为8.48%、8.97%和9.39%;添加在卷烟滤嘴中,卷烟品牌A、品牌B和品牌C的气相自由基清除率分别为17.36%、13.51%和18.89%,烤烟a、烤烟b和烤烟c分别为12.67%、17.33%和14.09%。与未添加Maillard反应产物比,添加Maillard反应产物后,烤烟a的烟香气较丰富,烟香味明显,甜感明显增加,回味较厚重。表明,刺梨-烟草提取物Maillard反应产物氮杂环类物质种类多,含量高,具有提升香气的作用;添加0.5% Maillard反应产物,其清除烟气中气相自由基的效果最佳,且添加在滤嘴中的效果更好;添加3‰Maillard反应产物可有效改善烤烟的感官质量。