组织特异性基因敲除小鼠生产的动物遗传学综合实验设计

熊 燕， 熊显荣， 李志雄， 付 伟， 王 利， 林亚秋

（西南民族大学畜牧兽医学院，成都 610041）

0 引言

在“双一流”高等教育背景下，学生对课程知识的掌握程度只是评价教学质量好坏的标准之一，学生的应用能力和创新思维培养才是关键［1］。实验教学是理工农医等学科专业课教学必不可少的实践环节［2］。高质量的实验教学不仅要实现对理论教学内容的内化，而且更要注重学生实践能力、创新能力及解决复杂问题综合能力的培养［3］。目前动物遗传学课程实验教学主要以“教师演示+学生照做”的教学模式进行授课［4-5］。教师提前准备好实验相关试剂耗材；按照实验指导书给学生进行讲解和指导，缺乏多元化和现代化教学手段，学生的参与度有限，较难提高学生对实验的兴趣和主动性。随着信息技术的快速发展，针对上述实验教学中的普遍存在的问题，融合线上线下的教学平台［6］，教学设计体现学生的主体地位，采用混合式教学模式将极大提高学生的参与度和积极性。

高等教育教学活动和科学研究相辅相成，2019 年教育部发布《关于深化本科教育教学改革全面提升人才培养质量的意见》，鼓励教师将最新科研成果转化为教学内容［7-8］。可见高校科研与教学相结合进行创新人才培养是时代的需要，也是高校坚持“以本为本”的体现，同时亦是提高实验教学水平的有效途径［9］。本教学团队成员长期围绕组蛋白去甲基化酶KDM2A基因探索其在胚胎发育、骨骼肌生长和脂肪沉积中的生物学功能［10］，构建了KDM2Aflox／-基因编辑小鼠，保存有卵母细胞［11］、骨骼肌（Pax7）［12］和脂肪组织（Adipoq）特异表达基因启动子介导Cre 表达的工具鼠［13］。以教研团队的基因编辑小鼠（KDM2Aflox／-）和Adipoq-Cre工具鼠科为材料，通过设计3 代杂交实验方案，提取小鼠基因组DNA，采用PCR 技术检测KDM2A和Cre 的基因型，旨在获得脂肪组织特异的KDM2A基因敲除小鼠。该实验教学设计采用线上线下混合的模式，融入经典遗传学与本学科前沿知识与技能，具有综合性、设计性、研究性及趣味性的特点；教学设计以学生为中心，充分提高学生的参与度及主动性，真正培养了学生实践能力、创新能力及解决复杂问题的综合能力。

1 实验教学设计

随着基因编辑技术的快速发展及应用优势的不断突显，该技术已加入最新版《动物遗传学》教材中，在生物技术其他相关课程作为独立章节进行介绍。在动物生产中，研究者利用该技术制备了基因编辑猪、羊等家畜动物，在生物医学和动物分子育种领域取得了重大突破［14］。因此紧密结合学科发展前沿及产业需求，本实验教学设计了基于基因编辑技术及检测手段的综合实验（见图1），实验内容丰富、新颖有趣；在教学方式上，融合线上和线下实践平台，在课前、实践课堂和课后多个维度调动学生的积极性及参与度。

图1 KDM2A基因脂肪组织特异敲除小鼠获得及基因型鉴定实验教学设计

1.1 课前学习

通过小规模专有在线课程（Small Private Online Course，SPOC）平台学习基因编辑、Cre-Loxp 等实验相关前沿技术原理、熟悉实验操作手册、发布获得脂肪组织特异KDM2A敲除小鼠的任务，引导学生利用KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre 小鼠设计杂交原理获得Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠的实验方案，满足学生的个性化学习的需求［15］；小鼠杂交实验操作相对简单，但整个周期较长，鉴于本教学团队在科研项目实施过程中已获得F3 代的小鼠，教师仅需课前准备F3 代小鼠即可。

1.2 课堂学习

首先实验小组以PPT形式汇报小鼠杂交方案，学生互动，教师给予点评指导，优化实验方案，以期快速高效、最低成本获得脂肪组织特异KDM2A 基因敲除小鼠；然后教师解析小鼠DNA纯化及基因型分型关键步骤，并强调注意事项；学生正式开始实验，教师及时指导学生的实验过程，并做好学生实践情况的详细记录，作为实验成绩的评价指标之一。

1.3 课后学习

学生完成实验后，分析实验数据并按要求撰写实验报告；将实验报告上传至SPOC的作业模块，每份实验报告至少由5 位同学进行互评，系统自动去掉最高分与最低分，获得平均分；教师根据实验课的过程记录、结果讨论及分析，对实验成绩进行确认；最后反思整个教学设计及实施过程，线上补充薄弱知识点，进行线上互动和讨论。

2 实验部分

2.1 实验目的

（1）深入理解基因编辑技术的原理及在动物生产中的应用；

（2）正确设计动物杂交实验方案，获得基因敲除动物；

（3）熟练运用PCR 技术对动物进行基因分型及个体鉴定。

2.2 实验动物、仪器及试剂

实验动物 KDM2A 基因编辑杂合小鼠（KDM2Aflox／-）和Adipoq-Cre小鼠。

试剂 组织DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）、引物、Rapid Taq PCR Master Mix、琼脂糖、TAE、核酸染料、DNA Marker等。

仪器组织超声破碎仪、离心机、水平电泳仪、凝胶成像系统、PCR 仪、超微量紫外分光光度计（NanoPhotometer）。

2.3 KDM2A基因编辑纯合小鼠杂交方案设计

根据现有两个品系小鼠基因型分别为KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre小鼠，利用孟德尔的基因分离定律和自由组合定律原理，通过设计3 代的杂交实验，最后获得基因型为Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox，并画出遗传图谱。

2.4 小鼠耳组织基因组DNA纯化

小鼠耳组织的DNA 纯化按照天根生化科技有限公司（货号：DP304）的操作手册进行实验，关键步骤如下：

（1）小鼠耳组织超声打碎为细胞悬液，然后10000 r／min离心1 min，去上清，加入200 μL 的GA缓冲液，振荡至彻底悬浮。

（2）加入Proteinase K混匀后，在56 ℃放置，直至组织溶解。

（3）加入200 μL 缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮。

（4）加入200 μL 无水乙醇，充分振荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀。

（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3 中，12000 r／min离心30 s，弃废液。

（6）向吸附柱CB3 中加入500 μL 缓冲液GD，12000 r／min离心30 s，弃废液。

（7）向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，12000 r／min离心30 s；并重复洗涤一次；弃废液后，吸附柱室温放置数分钟晾干。

（8）将吸附柱CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 ～200 μL 洗脱缓冲液TE，室温放置2 ～5 min，12000 r／min离心2 min，将溶液收集到离心管中。

2.5 基因组DNA的质量检测

以洗脱缓冲液TE 为空白，用NanoPhotometer 分光光度计测纯化DNA溶液的浓度和吸光度值，OD260／OD280比值应该在1.8 ～2.0。超过该范围意味着DNA样品中可能存在蛋白质或RNA污染。将DNA质量符合要求的样品，稀释到浓度为50 ng／μL。

2.6 KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre基因型PCR检测

以提取的基因组DNA 为模板，采用KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre的检测引物（见表1）进行PCR扩增，对KDM2Aflox／flox、KDM2Aflox／-、KDM2A-／-、Adipoq-Cre+和Adipoq-Cre-的基因型进行鉴定。PCR 扩增体系25 μL：2 ×Rapid Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL，PCR反应程序见表2。

表1 基因分型检测的引物序列

表2 KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre的PCR反应程序

2.7 琼脂糖凝胶电泳检测

取10 μL PCR反应的扩增溶液，加入2%的琼脂糖凝胶（含核酸染料）的点样孔，设置DNA maker（点样5 μL）孔，用1 ×TAE 缓冲液进行电泳，120 V 下电泳30 min，电泳结束后利用凝胶成像系统观察并照相。

3 结果与分析

3.1 杂交方案及遗传图谱

利用Cre-Loxp系统获得脂肪组织特异敲除小鼠，即Cre 重组酶特异识别KDM2A 基因两侧的Loxp 位点，切除KDM2A 基因序列［见图2（a）］。现有KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre 小鼠品系，设计可行的杂交方案，获得脂肪组织特异的KDM2A敲除小鼠，即基因型为Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox（见图3）。如图2（b）所示，首先选择KDM2Aflox／-的公母小鼠交配获得KDM2Aflox／flox纯合小鼠（F1 代）；然后将KDM2Aflox／flox纯合小鼠与Adipoq-Cre+杂交筛选Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠（F2 代）；最后将Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠与KDM2Aflox／flox纯合小鼠交配，筛选Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠（F3 代）。

图2 获得Adipoq-Cre +-KDM2Aflox／flox小鼠的杂交方案

图3 Adipoq-Cre +-KDM2Aflox／flox为KDM2A脂肪组织特异敲除小鼠

3.2 DNA纯化质量检测

提供20 只F3 代小鼠的耳组织样品，按照试剂盒操作手册纯化DNA，采用微量分光光度计测定其浓度及纯度。首先用洗脱缓冲液TE 校正仪器，吸取1 μL样品进行测定。如表3 所示DNA 的浓度在50 ng／μL左右，OD260／OD280比值均在1.8 ～2.0 之间，测定峰值为单峰（见图4），说明提取的DNA质量满足后续PCR实验的需求。

表3 DNA样品浓度及纯度检测

图4 纯化DNA浓度测定结果

3.3 琼脂糖凝胶电泳图谱

根据设计引物目的条带大小，判断小鼠基因型。针对KDM2A 小鼠的基因型，扩增片段大小仅510 bp为KDM2Aflox／flox，出现510 bp和397 bp 两条带为杂合小鼠（KDM2Aflox／-），扩增片段大小仅397 bp为野生型小鼠（KDM2A-／-）。针对Adipoq-Cre 小鼠的基因型，出现410 bp 的条带，即为Adipoq-Cre+小鼠，否则为Adipoq-Cre-小鼠。如图5 所示，3、5、10、12、19 号是Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠，也是本实验所需要获得的脂肪组织KDM2A 基因特异敲除的小鼠。2、9、11、16、17 号是Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠；1、13、14号为KDM2A 杂合小鼠（KDM2Aflox／-），4、6、7、8、15、18、20 为KDM2A 纯合小鼠（KDM2Aflox／flox）。表明通过3 代的杂交实验可获得组织组织KDM2A基因特异敲除小鼠，其比例为25%。

图5 琼脂糖凝胶检测小鼠基因分型的结果

4 实验教学效果

“KDM2A基因脂肪组织特异敲除小鼠生产及基因型鉴定”实验教学设计及教学过程具有高阶性、创新性和挑战度，充分调动学生的积极性与参与度，提高学生解决复杂问题的综合能力，培养学生实践和创新能力。

4.1 “三个维度”调动学生的积极性与参与度

该实验教学设计在课前、实践课堂及课后体现了“以学生为中心”的教学理念。课前学习内容紧扣学科发展前沿及行业需求，小鼠杂交方案设计的任务驱动环节具有探究性，提高了学生的主动性及课程的趣味性。实践课堂教学，小组成员全程参与杂交方案汇报、方案优化研讨及实验操作，教师加强每个小组的过程记录，及时给予反馈；此外，所提供小鼠的基因型教师亦未知，实验具有挑战性与研究性，实验结果使学生更有获得感。课后，学生积极参与同学实验报告的互评及讨论交流。以上教学设计与实施充分利用线上线下平台融合，从多个维度让学生忙起来，提高学生的参与度。

4.2 提高学生解决复杂问题的综合能力

该实验涉及遗传学的多个经典与前沿知识，包括孟德尔分离定律和自由组合定律、分子遗传学的基本理论、分子生物学检测技术、基因编辑技术、Cre-loxp组织特异性基因敲除技术等。实验本身具有很强的综合性与设计性，加上检测小鼠的基因型事先未知，提高实验的挑战度与探究性。在整个杂交实验设计及操作过程中，需要学生有理论联系实际、化繁为简、有机整合的工作与学习思路，锻炼了学生解决复杂问题的综合能力。

4.3 培养学生实践与创新能力

该实验内容源于本教学团队的科研成果，KDM2Aflox／-基因编辑小鼠由团队首次构建［16］，实验内容具有前沿性；在杂交实验设计环节，每组的设计方案不拘一格，锻炼了学生的创新思维；课前、课中和课后都有不同形式的讨论环节及作业互评，极大地锻炼学生的辩证与批判思维。

5 结语

“脂肪组织KDM2A 基因特异敲除小鼠获得及基因型鉴定”的综合实验设计，已在动物遗传学的实验教学取得较好的教学效果。鉴于该实验动物为小鼠、实验内容前沿，实验具有综合性、挑战性及创新性，同样可作为生物技术、生物工程、医学等专业遗传学课程的实验教学内容进行推广。此外，本实验教学设计基于线上线下混合的教学模式，融合线上线下平台资源，体现学生的主体地位，极大提高学生的主动性及参与度，这种模式为其他实验课教学提供了借鉴。