高效液相色谱法测定饲料中5种磺胺类药物

陈海燕，张慧宁，马春芳，陈 娟，杨俊华，谢荣国，杨 奇

（宁夏回族自治区兽药饲料监察所，银川 750001）

目前有效的抗生素很多，但磺胺类药具有抗菌谱广、性质稳定、品种多、价格低、使用简便等优点[1]，在控制急性泌尿系统感染中有重要价值。所以在畜牧养殖业中常被用作治疗动物肠道感染等疾病，若以预防为目的在饲料中长期添加，会使致病菌产生耐药性，磺胺类药物也因此会残留在动物的肌肉等组织中，影响人的身体健康[2]。磺胺类抗生素还可以通过沉降、吸附等作用蓄积在地表水沉积物中[3]，造成水体污染。农业农村部第194号公告颁布后，磺胺类药物禁止作为饲料药物添加剂被使用，其检测对饲料质量安全控制十分必要。高效液相色谱检测法能够对饲料中的磺胺类药物含量进行快速检测，且检测结果准确，误差小，利于相关人员开展饲料中磺胺类药物含量测定[4]。本研究采用高效液相色谱法，对饲料中磺胺类药物进行测定，将GB/T 19542—2007[5]《饲料中磺胺类药物的测定高效液项色谱法》中称样容器锥形瓶改为离心管，提取液乙腈体积减半，验证建立更加合理、利于操作的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪（型号为Agilent 1260 infinity Ⅱ），安捷伦科技有限公司产品；离心机（型号为CR22G），日本日立公司产品；旋涡混匀器（型号为IKA MS3），德国艾卡公司产品，分析天平（型号为AX-205）、电子天平（型号为LD202-L），梅特勒-托利多公司产品；超声清洗器（型号为KQ-400KDB），昆山舒美超声仪器有限公司产品；固相萃取装置（型号为SepLine-S4），莱伯泰科有限公司产品；振荡器（型号为WSZ-100-A），上海一恒科学仪器有限公司产品；纯水仪（型号为Milli-Q Integral 5），默克密理博公司产品。

1.2 仪器条件

色谱条件：紫外检测器，检测波长为270 nm；色谱柱，Agilent C18柱，柱长250 mm，内径4.6 mm；流动相：乙腈∶4%冰乙酸水=25%∶75%，流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL。

1.3 检出限与定量限

该方法的定量限，磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶为5 mg·kg-1；磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉为2 mg·kg-1。

1.4 试剂

乙腈（色谱级，批号为178563）、甲醇（色谱级，批号为175614），Fisher chemical 产品；冰乙酸（优级纯，批号为180219），天津市科密欧化学试剂有限公司产品；超纯水，德国默克密理博Milli-Q Integral 5 制得；碱性氧化铝SPE 小柱（批号为029639192A），沃特世Waters Spe-Pak 1 000 mg·（12 mL）-1。

1.5 标准品

1.5.1 标准贮备液配制

标准贮备液配制过程见表1。配制好后在-16 ℃避光保存，有效期6个月。

1.5.2 混合标准中间液

表1 标准贮备液配制

表2 5种磺胺类药物的回收率及精密度

分别量取一定体积的标准贮备液置于同一25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，使其成为浓度100 μg·mL-1的混合标准中间液。4 ℃避光保存，有效期1个月。

1.5.3 绘制混合标准工作曲线

准确量取混合标准中间液10、20、50、150 μL和500 μL，分别置于10 mL 的棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，使浓度分别0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1，绘制混合标准工作曲线。

1.6 样品制备及处理

样品制备：选具有代表性的饲料500 g，粉碎过40目筛，混匀备用。

提取：准确称取2 g（精确至0.001 g）试样于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈，涡旋1 min，振荡30 min，9 000 r·min-1离心5 min，备用，同时做空白对照。

净化过程：碱性氧化铝SPE小柱，取10 mL乙腈淋洗，准确移去10 mL样品试液过滤，流出后吹干。分别用2 mL 流动相洗脱2 次，收集洗脱液混匀，过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.7 阳性添加样品

向称取的样品中分别加入20、40、100 μL 和300 μL浓度为100 μg·mL-1的混合标准贮备液，制成浓度为1、2、5mg·kg-1和7.5mg·kg-1的阳性添加样品，上机浓度分别为0.2、0.4、1.0 μg·mL-1和1.5 μg·mL-1，每个浓度阳性添加做6个平行，连续3次。

2 结果与分析

2.1 色谱图

5 种磺胺类药物0.2 μg·mL-1的标准图谱，1 mg·kg-1阳性添加回收及空白样品图谱见图1～3。

图1 5种磺胺类药物0.2 μg·mL-1标准图谱

图2 5种磺胺类药物1 μg·mL-1回收图谱

因饲料中粗蛋白等含量较高，基质复杂容易对目标物形成干扰，选用乙腈做流动相，可以沉淀蛋白质；流动相的pH 会影响磺胺类药物在色谱柱中的分离，水相选用4%的冰乙酸水利于不同磺胺类药物的分离。试验结果表明：5种磺胺类药物标准图谱与添加回收图谱的色谱峰保留时间一致，且峰形良好，分离度好，互不干扰，说明流动相比例合理；由添加回收图谱可以看出，样品基质对添加回收影响小，说明试验条件及方法可行。

2.2 标准曲线

以含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图4～8。

图4 磺胺嘧啶的标准曲线

图6 磺胺二甲基嘧啶的标准曲线

图7 磺胺甲恶唑的标准曲线

图8 磺胺喹恶啉的标准曲线

由图4～8可以看出，5种磺胺类药物回归方程分别为：磺胺嘧啶y=87.484 9x-0.874 3，磺胺间甲氧y=72.653 2x-0.765 0，磺胺二甲基嘧啶y=75.852 7x-0.717 9，磺胺甲恶唑y=75.664 7x-0.816 4，磺胺喹恶啉y=66.821 4x-1.231 0，5 种药物5 个浓度（0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1）的线性均在0.999 9以上，线性良好。

2.3 回收率

阳性添加浓度为0.2、0.4、1.0mg·kg-1和1.5mg·kg-1四个浓度时，平均回收率为85.8%～113.0%，变异系数（RSD）为0.2%～7.6%，说明该方法精密度良好，符合方法学要求。

2.4 注意事项

磺胺类药物属于酸碱两性物质[6]，标准贮备液配制过程中，磺胺喹恶啉超声后若有混浊不溶现象，可适量加0.1%氢氧化钠溶液50～100 μL，直至溶解后定容。标准品配制过程中，所用的容量瓶均建议采用棕色。

3 应 用

2022 年对宁夏区内生产企业、经营店、养殖场的猪鸡配合饲料38 批次牛、羊精料补充料44 批次、自配料38批次，共计120批次饲料样品，应用该方法进行检测，均未检出上述5 种磺胺类药物，检测结果见表3。

4 讨 论

自饲料中禁止使用抗生素公告颁布后，饲料中抗生素检测成为检验检测机构的主要任务，磺胺类药物为抗菌药品种数量最多的人工合成药物。饲料中磺胺类药物分析测定方法有多种，例如高效液相色谱法[7-9]、液相色谱-串联质谱法[10-11]、酶联免疫法、放射受体分析法等，液相色谱-串联质谱检测法成本较高，酶联免疫法易出现假阳性、假阴性反应，需用高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱法进行确证，放射受体分析法有时会出现交叉反应及假阳性反应，样品处理复杂，其中高校液相色谱法较成熟并被广泛应用。本研究针对《饲料中磺胺类药物的测定高效液相色谱法》中的前处理方法进行了改进，改进后的方法更加便捷、高效，更有利于进行大批量饲料样品中常见磺胺类药物的风险监测。

5 结 论

利用高效液相色谱法测定饲料中5种磺胺类药物，将GB/T 19542—2007方法中称样容器锥形瓶改为离心管，利于样品旋涡、振摇、离心等操作。提取液体积由50 mL乙腈改为25 mL，降低有机试剂的使用量，减少环境污染及对操作人员的毒性作用。改进后的方法更为简单，利于操作和样品的批量处理。经验证，改进的方法各项参数均符合方法学要求，可用于饲料中非法添加磺胺类药物的检测，对饲料禁止使用磺胺类药物的筛查具有重要意义。