葛根素基于IL-33/ST2通路对PE大鼠胎盘组织损伤的作用

李格琳 ,臧密密 ,付雪莲

1.沧州市人民医院产科,沧州 061000;2. 沧州市人民医院妊娠糖尿病科,沧州 061000;3. 沧州市人民医院妇产科,沧州 061000

子痫前期(preeclampsia,PE)是一种妊娠特异性综合征,其进展与胎盘灌注不足及由缺氧导致的胎盘功能不全有关,表现为血压异常升高、局部水肿和蛋白尿等,是导致早产儿、孕产妇和围产儿发病及死亡的主要原因[1-2]。PE病理机制复杂,潜在病因包括内皮功能障碍[3]、氧化应激[4]、免疫失衡及炎症反应[5]等。白细胞介素-33(interleukin-33,IL-33)在主动或被动损伤中作为警报细胞因子或内源性信号被细胞释放,与其受体即生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulating expression gene 2 protein,ST2)及白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)受体辅助蛋白组成的二聚体结合进而参与PE多种病理过程[6]。葛根素可改善PE大鼠氧化应激过度激活及免疫失衡[7],提示其具有预防和治疗PE的潜力,本实验拟构建PE大鼠模型,探讨葛根素对PE大鼠胎盘损伤影响,以期阐明其可能的作用机制并为PE治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BP-98A/B鼠尾无创血压仪(北京软隆生物技术有限公司);Multiskan FC多功能酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司);FluorChem M化学发光凝胶成像系统(美国ProteinSimple公司)。

1.2 试药

葛根素(质量分数≥98%,云南力莲生物有限公司);阿司匹林(拜耳医药保健有限公司);亚硝基左旋精氨酸甲酯(nitrosoL-arginine methyl ester,L-NAME,美国Sigma公司);肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-4(interleukin 4,IL-4)及白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10),均购自武汉艾美捷科技有限公司;干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ,上海远慕生物科技有限公司);可溶性生长刺激表达基因2蛋白(soluble growth stimulating expression gene 2 protein,sST2)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自上海酶研生物科技有限公司;IL-33 ELISA试剂盒、兔抗IL-33单克隆抗体、兔抗生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulating gene 2 protein,ST2)多克隆抗体,均购自美国Abcam公司。

1.3 实验动物

SPF级雌性、雄性7周龄Wistar大鼠各60只,体质量为(200±10) g,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供,许可证号为SCXK(鲁)2019-0003。

2 方法

2.1 造模、分组及给药

可育雌性及雄性Wistar大鼠于恒温(22 ℃～24 ℃),相对湿度为50%～60%环境下普通饲养,12 h光-暗交替,适应1周后,将雌性及雄性大鼠按照1∶1比例合笼交配,每日阴道涂片,见有精子即记录为妊娠第0天(encyesis day 0,Ed 0)[8]。剔除未妊娠大鼠7只及孕鼠3只,剩余孕鼠随机分为对照组、模型组、葛根素低剂量组、葛根素高剂量组及阿司匹林组,每组10只。除对照组外,其余组孕鼠均于Ed 13～Ed 21皮下注射50 mg·kg-1L-NAME以诱导PE模型,对照组皮下注射等量生理盐水,且葛根素低剂量、高剂量组[9]及阿司匹林组[10]孕鼠均于Ed 15～Ed 21治疗,分别按照40、80、2 mg·kg-1灌服给药,对照组及模型组孕鼠灌服等体积生理盐水,每日1次。

2.2 样品采集与处理

于Ed 15、Ed 21用无创血压仪检测各组大鼠尾动脉血压;于Ed 20将孕鼠分别置于单独的代谢笼中,收集24 h尿液样本用于检测孕鼠24 h尿蛋白;腹腔注射戊巴比妥钠(80 mg·kg-1)麻醉各组孕鼠,心脏取血,4 ℃静置过夜,收集血清,以1 500 r·min-1、4 ℃离心10 min,取上清用于ELISA检测;记录各组大鼠孕有仔鼠数量及存活率;大鼠及仔鼠均实施安乐死,取胎盘组织称质量,并分别保存于40 g·L-1多聚甲醛和液氮中,用于组织病理学染色、LDH活性及蛋白质印迹法(Western blotting)检测。

2.3 Bradford法定量大鼠24 h尿蛋白

设置对照孔及样本孔:蛋白对照品稀释至0.5 μg·μL-1,吸取不同体积对照品置于标准孔内,用磷酸盐缓冲溶液补足至20 μL,于反应孔内加入稀释20倍的尿液样本20 μL,于对照孔及样本孔内均加入200 μL考马斯亮蓝G250染色液,混匀,室温静置5 min,于570 nm波长处测定各孔吸光度(A)值,绘制标准曲线并计算尿液样本24 h尿蛋白含量。

2.4 HE染色观察胎盘组织病理学变化

胎盘组织经40 g·L-1多聚甲醛固定24 h,常规石蜡包埋,制备成5 μm石蜡切片,二甲苯脱蜡至水,苏木素染核5 min,体积分数1%盐酸乙醇分化10 s,氨水返蓝3 s,水洗,伊红染液染核30 s,水洗,脱水透明,晾干后用中性树胶封片,镜下观察并采集图片。

2.5 TUNEL染色检测胎盘滋养层细胞凋亡指数

用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、无DNase蛋白酶K溶液处理20 min,50 μL TUNEL反应液反应1 h,过氧化物酶封闭,与底物二氨基联苯胺混合液反应显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。见细胞质或细胞核中有棕色颗粒,即呈染色阳性。细胞凋亡指数=(TUNEL阳性细胞数/细胞总数)×100%。

2.6 ELISA检测大鼠血清中相关因子水平

设置对照品孔和样本孔,分别滴加50 μL不同质量浓度对照品及10倍稀释的待测样品,加酶标工作液温育1 h,洗板,依次加底物A、B避光孵育15 min,滴加终止液终止反应,于450 nm波长处测定各孔A值,以对照品质量浓度作横坐标、对应A值作纵坐标,绘制出对照品线性回归曲线,计算各组大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-33及sST2的水平。

2.7 IL-33、ST2L蛋白相对表达水平

取液氮保存的各组大鼠胎盘组织,研钵碾碎,用预冷的RIPA裂解液裂解,匀浆后离心,取上清,测定蛋白质量浓度并加热变性蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳(压缩胶60 V 25 min,分离胶120 V 62 min),转膜(200 mA,110 min),50 mg·mL-1脱脂乳(1×TBST稀释)室温封闭PVDF膜2 h;后加一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜;次日洗膜,换液6次,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(1∶8 000稀释)室温孵育2 h,洗膜,换液6次,ECL反应显影,于化学发光凝胶成像系统中观察并记录。Image J软件分析条带灰度值,以目的蛋白IL-33、ST2L与内参β-actin灰度值的比值表示蛋白的相对表达水平。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠Ed 15、Ed 21尾动脉血压

尾动脉血压测量结果显示,各组大鼠Ed 15尾动脉血压比较差异无统计学意义(P>0.05),Ed 21尾动脉血压比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠Ed 21尾动脉血压升高(P<0.05);与模型组比较,3个给药组大鼠Ed 21尾动脉血压降低(P<0.05);与葛根素低剂量组比较,葛根素高剂量组、阿司匹林组大鼠Ed 21尾动脉血压降低(P<0.05),阿司匹林组最低(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠Ed 15、Ed 21尾动脉血压

3.2 大鼠24 h尿蛋白含量

尿蛋白定量结果显示,各组大鼠24 h尿蛋白含量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠24 h尿蛋白含量增加(P<0.05);与模型组比较,3个给药组大鼠24 h尿蛋白含量减少(P<0.05);与葛根素低剂量组比较,葛根素高剂量组、阿司匹林组大鼠24 h尿蛋白含量减少(P<0.05),阿司匹林组含量最少(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠24 h尿蛋白含量

3.3 大鼠孕有仔鼠的数量及存活率

各组大鼠孕有仔鼠的数量及仔鼠存活率比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠孕有仔鼠的数量及仔鼠存活率降低(P<0.05);与模型组比较,3个给药组大鼠孕有仔鼠的数量及仔鼠存活率升高(P<0.05);与葛根素低剂量组比较,葛根素高剂量组、阿司匹林组大鼠孕有仔鼠的数量及仔鼠存活率升高(P<0.05),阿司匹林组最高(P<0.05)。见表3。

表3 大鼠孕有仔鼠的数量及仔鼠的存活率

3.4 大鼠胎盘组织的质量

结果显示,各组大鼠胎盘组织质量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠胎盘组织质量减轻(P<0.05);与模型组比较,3个给药组大鼠胎盘组织质量增加(P<0.05);与葛根素低剂量组比较,葛根素高剂量组、阿司匹林组大鼠胎盘组织质量增加(P<0.05),阿司匹林组质量增加更明显(P<0.05)。见表4。

表4 大鼠胎盘组织的质量

3.5 孕鼠胎盘组织的病理变化情况

HE染色结果显示,对照组大鼠胎盘组织未见炎性浸润,细胞排列有序,结构完整、规则,毛细血管分布均匀;与对照组比较,模型组大鼠胎盘组织结构紊乱,毛细血管减少,细胞间隙变大,排列疏松,见明显炎性浸润;与模型组比较,3个给药组大鼠胎盘组织病理情况均改善。见图1。

注:A.对照组;B.模型组;C.葛根素低剂量组;D.葛根素高剂量;E.阿司匹林组。

3.6 孕鼠胎盘滋养层细胞的凋亡情况

TUNEL染色结果显示,4组大鼠胎盘滋养层细胞凋亡指数比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,3个给药组大鼠胎盘滋养层细胞凋亡指数降低(P<0.05);与葛根素低剂量组比较,葛根素高剂量组及阿司匹林组大鼠胎盘滋养层细胞凋亡指数降低(P<0.05),阿司匹林组降低更多(P<0.05)。见表5、图2。

表5 大鼠胎盘滋养层细胞的凋亡情况

3.7 大鼠的血清诸项指标水平

ELISA结果显示,各组大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-33及sST2水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IFN-γ及sST2水平升高,IL-4、IL-10及IL-33水平降低(P<0.05);与模型组比较,3个给药组大鼠血清TNF-α、IFN-γ及sST2水平降低,IL-4、IL-10及IL-33水平升高(P<0.05);与葛根素低剂量组比较,葛根素高剂量组、阿司匹林组大鼠血清TNF-α、IFN-γ及sST2水平降低,IL-4、IL-10及IL-33水平升高(P<0.05),阿司匹林组诸项指数水平的变化更明显(P<0.05)。见表6。

表6 大鼠血清相关因子水平

3.8 孕鼠胎盘组织的诸项蛋白表达水平

Western blotting结果显示,各组大鼠胎盘组织中IL-33、ST2L蛋白相对表达水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠胎盘组织中IL-33蛋白相对表达水平降低,ST2L蛋白相对表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,3个给药组大鼠胎盘组织中IL-33蛋白相对表达水平升高,ST2L蛋白相对表达水平降低(P<0.05);与葛根素低剂量组比较,葛根素高剂量组及阿司匹林组大鼠胎盘组织中IL-33蛋白相对表达水平升高,ST2L蛋白相对表达水平降低(P<0.05),阿司匹林组诸项蛋白相对表达水平的变化更明显(P<0.05)。见图3、表7。

注:A.对照组;B.模型组;C.葛根素低剂量组;D.葛根素高剂量;E.阿司匹林组。

表7 大鼠胎盘组织中IL-33、ST2L蛋白相对表达水平n=10)

4 讨论

一氧化氮对于正常的螺旋动脉重塑和妊娠至关重要,其缺乏可导致妊娠小鼠PE子宫及胎盘病理改变[11],L-NAME为一氧化氮合酶抑制剂,常用于诱导构建PE大鼠模型[12]。本研究中皮下注射L-NAME初期各组妊娠大鼠尾动脉血压比较差异无统计学意义,经连续注射后,与对照组比较,模型组大鼠尾动脉血压及24 h尿蛋白含量均显著升高,表明L-NAME于妊娠中后期可诱发PE综合征,表现为高血压和蛋白尿[13],提示成功构建PE大鼠模型。

阿司匹林是目前唯一推荐的被用作预防PE的妊娠干预药物[14],可通过促炎通路改善PE症状及人滋养层细胞损伤[15-16],本研究结果显示,与模型组比较,大鼠尾动脉血压及24 h尿蛋白含量降低,表明葛根素可降低孕鼠前期子痫高血压并缓解蛋白尿症状;胎盘为母体及胎儿之间呼吸气体、营养物质及废物的运输器官,其生长及发育对胎儿的正常生长和存活至关重要,其中胎盘滋养层细胞发生炎症和细胞凋亡过度激活可导致胎盘异常[17]。胎儿生长受限主要在于妊娠早期子宫螺旋动脉重塑不足及胎盘分布血管减少[18-19],进而诱发的炎症反应及胎盘组织损伤可导致幼崽存活率下降[20],研究发现,PE大鼠孕有仔鼠数量及存活率均降低[21],与对照组比较,模型组大鼠胎盘组织质量减轻,结构紊乱,毛细血管减少,细胞间隙变大,见有明显炎性浸润且细胞凋亡严重,大鼠孕有仔鼠数量及仔鼠存活率均显著降低,而经葛根素低剂量、高剂量治疗后可改善胎盘组织病理和仔鼠生存情况,表明葛根素可改善PE症状,且可能与炎症反应相关。

正常妊娠与轻度全身性炎症反应和Th2细胞免疫偏向有关,当免疫细胞群体失调,Th1细胞免疫偏向促进慢性免疫激活,抗炎与促炎细胞因子失衡引起的强烈炎症反应将导致胎盘组织损伤并诱导PE发生[22]。TNF-α是母体免疫系统的重要介质,可通过增加血管通透性影响并损伤内皮细胞功能、诱导滋养层细胞凋亡,使母体炎症复杂化[23],许多研究表明,TNF-α在PE时质量浓度增加,IL-4、IL-10为抗炎细胞因子,由Th2细胞分泌,在PE中与促炎细胞因子呈负相关[24];IFN-γ由Th1细胞分泌,可有效诱导PE内皮激活及过度炎症发生[25]。本研究结果显示,与对照组比较,模型组大鼠血清中促炎因子TNF-α、IFN-γ水平升高,抗炎因子IL-4、IL-10水平降低,表明正常妊娠Th1/Th2免疫失衡可导致机体促炎状态反应,并促进PE发生、发展,经葛根素低、高剂量治疗后,TNF-α、IFN-γ水平降低,IL-4、IL-10水平升高,表明葛根素可能通过调节Th2细胞免疫偏向,促进免疫失衡状态的恢复,进而减轻炎症反应,改善PE病理症状。

IL-33释放至细胞外后可启动并维持Th2型相关免疫反应;当易位至细胞核时,可抑制促炎信号[6]。sST2被认为是IL-33的诱饵受体,高水平的sST2可与ST2L竞争性结合IL-33,促进Th1免疫反应,促进Th1细胞免疫偏向,ST2L则可刺激IL-33引起Th2细胞因子及免疫因子产生[26]。本研究结果显示,模型组大鼠血清sST2水平升高、IL-33水平降低;胎盘组织中ST2L蛋白相对表达水平升高、IL-33蛋白相对表达水平降低,表明循环中高水平sST2可能通过竞争性结合IL-33蛋白,导致ST2L蛋白相对表达水平升高,并促进免疫细胞偏向失调及促炎/抗炎状态的失衡,诱导PE发生及发展。葛根素低剂量、高剂量治疗后可有效降低sST2循环水平,提高IL-33含量,ST2L因结合IL-33而表现为蛋白相对表达水平降低,表明葛根素可能通过降低循环中诱饵受体sST2水平,提高循环及胎盘组织中IL-33含量促进Th2免疫细胞偏向及抗炎/促炎因子失调的恢复,进而改善PE大鼠胎盘组织损伤。

综上所述,葛根素可促进循环中抗炎/促炎因子失调的恢复,降低PE大鼠高血压及24 h尿蛋白含量,减轻胎盘组织结构病理改变,滋养层细胞的凋亡及孕鼠及仔鼠发病情况,其作用机制可能与降低sST2水平、促进IL-33的表达,进而调节免疫失衡有关。