金匮肾气丸中马钱苷、京尼平苷酸、23-乙酰泽泻醇B和β-蜕皮甾酮含量测定方法的建立

王开裕,林天东,吴振宁,许海丹

1.海南省中医院药学部,海口 570203; 2.海南省中医院国医大师工作室,海口 570203

金匮肾气丸不仅具有温补肾阳、化气行水等功效,还具有增强免疫力、抗衰老、改善糖脂代谢等药理作用,能增强神经-体液调节、改善垂体功能[1-3]。金匮肾气丸是由地黄、茯苓、山药等10味药材经粉碎、过筛、干燥、制丸等工艺加工而成的中药丸剂,在临床上常用于治疗肾虚水肿、腰膝酸软、小便不利、畏寒肢冷等病症[4-5]。山茱萸具有补益肝肾、收涩固脱等作用[6-8];泽泻具有利水渗湿、泻热、化浊、降脂等作用[9-11];牛膝具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨等作用[12-14];车前子具有清热、利尿、通淋、渗湿、止泻等作用[15-17]。金匮肾气丸现收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第二十册中,标准编号为WS3-B-3892-98,执行标准中仅有性状、鉴别和检查项目,缺少含量测定项目。随着我国人口老龄化趋势的加剧,老年病患者数量也在逐年增加,金匮肾气丸临床应用也越来越广。为保障患者的用药安全,有必要提高金匮肾气丸的检测标准。根据2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)中山茱萸、泽泻、牛膝和车前子含量测定项目,本研究建立了高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定金匮肾气丸中马钱苷、京尼平苷酸、23-乙酰泽泻醇B和β-蜕皮甾酮的含量检测方法[18-21],提高金匮肾气丸的检测标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦 1290 Infinity(配备G4513A型自动进样器、G1316C型柱温箱、G1315型二极管阵列检测器)购自美国Agilent科技有限公司;梅特勒 AE200型电子天平(精度为万分之一,瑞士Mettler-Toled科技有限公司);Capcell Pak UG C18色谱柱(日本资生堂科技有限公司);鑫欣XCD-NS-3C型多槽超声波清洗机(济宁鑫欣超声电子设备有限公司)。

1.2 试药

对照品:马钱苷(批号111640-201808,Cas号为18524-94-2,质量分数为99.0%),京尼平苷酸(批号111828-201805,Cas号为27741-01-1,质量分数为98.1%),23-乙酰泽泻醇B(批号111846-202006,Cas号为26575-95-1,质量分数为98.3%),β-蜕皮甾酮(批号111638-201907,Cas号为5289-74-7,质量分数为98.3%),均购自中国食品药品检定研究院。金匮肾气丸(规格为 6 g·丸-1,批号:211214、220112、220506,昆明中药厂有限公司);实验用水为超纯水,自制;乙腈、甲醇均为色谱纯,购自天津市科密欧试剂公司;其他试剂均为分析纯,购自上海化学试剂厂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

液相色谱柱为Capcell Pak UG C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。柱温为25 ℃。以乙腈为流动相A、3 mL·L-1磷酸溶液为流动相B,梯度洗脱,洗脱程序:0～4 min,14% A;4～16 min,14%～46% A;16～25 min,46%～91% A;25～30 min,91% A;31～31.5 min,14% A;京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B的检测波长分别设定为254、250、240、254 nm。流速为1.0 mL·min-1;进样量为10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1对照品储备液 取1.2项下马钱苷对照品,精密称取适量,置于10 mL棕色量瓶中,加甲醇制备每1 mL溶液中含马钱苷49.5 μg的溶液,即得马钱苷对照品储备液;同法制备每1 mL溶液中含京尼平苷酸、23-乙酰泽泻醇B和β-蜕皮甾酮分别为98.1、19.7、98.3 μg的储备液,分别加甲醇定容,摇匀,即得。

2.2.2对照品溶液 取2.2.1项下马钱苷、京尼平苷酸、23-乙酰泽泻醇B和β-蜕皮甾酮对照品储备液,分别精密移取1.0 mL,置于10 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,摇匀。

2.2.3阴性对照溶液 按照金匮肾气丸质量标准中的处方和制备方法,分别制备缺山茱萸、泽泻、牛膝、车前子的阴性样品,阴性样品溶液按照2.2.4项下供试品溶液制备方法制备,分别制得山茱萸、泽泻、牛膝、车前子阴性对照溶液。

2.2.4供试品溶液 取金匮肾气丸供试品(批号211214)适量,置于研钵中研成细粉,精密称取0.5 g,置于25 mL棕色量瓶中,加甲醇20 mL,超声提取20 min(超声功率设定为220 W,频率为75 Hz),提取完毕后,在室温下放冷,加甲醇定容,摇匀,滤过(0.45 μm滤膜),续滤液即为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1专属性考察 取2.2项下对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液,按照2.1项下色谱条件分别进样分析,采集色谱图;结果京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B在该色谱条件下分离良好,分离度均大于1.5,理论塔板数均不低于3 000,拖尾因子在0.95～1.05之间,符合《中国药典》的要求,且阴性供试品溶液中无干扰峰。典型色谱图见图1。

注:A.对照品溶液;B.阴性供试品溶液;C.供试品溶液;D.缺车前子供试品溶液;E.缺牛膝供试品溶液;F.缺山茱萸供试品溶液;G.缺泽泻供试品溶液;1.京尼平苷酸;2.β-蜕皮甾酮;3.马钱苷;4.23-乙酰泽泻醇B。

2.3.2线性关系考察 取2.2项下对照品储备溶液,分别准确移取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL,置于5个10 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,摇匀,按照2.1项下色谱条件,分别进样10 μL,采集色谱图并记录峰面积。以峰面积(y)为纵坐标、质量浓度(x)为横坐标进行线性回归,结果见表1。

表1 待测成分的回归方程、相关系数及线性范围

2.3.3仪器精密度考察 取2.2项下制备的对照品溶液,按照2.1项下色谱条件,分别连续进样6次,每次进样10 μL,采集色谱图并记录峰面积。根据色谱图记录的京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B峰面积计算相对标准偏差(RSD)。计算得京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD值分别为1.14%、1.33%、1.18%、1.04%,表明仪器的精密度良好。

2.3.4方法重复性考察 取金匮肾气丸供试品(批号为211214)适量,置于研钵中研成细粉,准确称取约0.5 g,平行取样6份,分别置于25 mL棕色量瓶中,后续按照2.2.4项下供试品溶液制备方法进行处理,得6份供试品溶液,按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL,采集色谱图并记录峰面积。根据京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B检测结果计算RSD。计算得京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B含量的RSD值分别为1.62%、1.31%、1.76%、1.24%,表明该方法的重复性良好。

2.3.5稳定性考察 取金匮肾气丸供试品(批号211214)适量,按照2.2.4项下供试品溶液制备方法进行处理,得供试品溶液,室温下放置,按照2.1项下色谱条件,分别于0、2、4、8、12、24 h取样分析,采集色谱图并记录峰面积。根据京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B的峰面积计算RSD。计算得京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD值分别为1.41%、1.27%、1.61%、1.52%,表明溶液在24 h内稳定。

2.3.6加样回收率考察 取已测定京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B含量的金匮肾气丸供试品(批号211214)适量,准确称取0.5 g,置于25 mL棕色量瓶中,平行取样6份,分别加入2.2.1项下制备的对照品储备液适量,后续按照2.2.4项下供试品溶液制备方法进行处理,得6份加样溶液;按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL,采集色谱图并记录峰面积,计算加样回收率。结果见表2。

表2 样品加样回收率结果

2.4 市售样品检测应用

分别取金匮肾气丸适量,按照2.2.4项下供试品溶液进行前处理,得供试品溶液;按照2.1项下色谱条件分别进样分析,采集色谱图,根据峰面积计算京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B的含量。结果见表3。

表3 样品含量检测结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

实验选取金匮肾气丸组成中的山茱萸、泽泻、牛膝、车前子4种药材的活性成分作为其质量控制的指标。取2.2.2项下制备的京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B对照品溶液,按照2.1项下色谱条件,分别进样10 μL上述溶液,设置波长扫描为200～600 nm,采集4种成分的色谱图。结果显示京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B的最大吸收波长分别为254、250、240、254 nm;差异较大,为提高检测效率,实验采用程序波长切换技术,实现了在同一色谱条件下,在4种成分最大吸收波长处分别测定其含量。

3.2 流动相的选择

液相色谱法常用的流动相有甲醇体系和乙腈体系,实验分别选择水-甲醇、水-乙腈、甲醇-3 mL·L-1磷酸溶液和乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液作为流动相体系,考察京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B的出峰时间、分离效果等情况。

结果显示,选择甲醇体系时,3种目标物出峰时间较长,检测效率偏低,且23-乙酰泽泻醇B基线噪音较大,定量结果准确度偏低;选择水-乙腈体系时,β-蜕皮甾酮和马钱苷色谱峰发生分叉,可能原因是β-蜕皮甾酮和马钱苷在纯化水状态下,存在2种分子状态,这2种分子在该色谱条件下微弱分离,导致定量结果不准确;选择乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液时,京尼平苷酸、β-蜕皮甾酮、马钱苷和23-乙酰泽泻醇B分离良好,分析时间较短,且无基质干扰。故实验选择乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液作为流动相体系。

综上所述,实验以金匮肾气丸为研究对象,选取其药材组成中的山茱萸、泽泻、牛膝、车前子的活性成分作为研究目标,建立能同时检测金匮肾气丸中马钱苷、京尼平苷酸、23-乙酰泽泻醇B和β-蜕皮甾酮4种成分含量的HPLC法。对该方法的重复性、线性、回收率等进行了考察,并对前处理的条件进行了优化。结果表明,该方法具有前处理简单、分析时间短、检测结果准确等优点,适用于金匮肾气丸的质量控制。