海绵共生木霉属真菌绿木霉中1个新的倍半萜类化合物

张 璐，刘辰鹏，王瑞琪，焦伟华，张小坡*

海绵共生木霉属真菌绿木霉中1个新的倍半萜类化合物

张 璐1, 2，刘辰鹏1，王瑞琪1，焦伟华2，张小坡1*

1. 海南医学院药学院，海南 海口 571199 2. 上海交通大学医学院附属仁济医院 药学部海洋药物研究中心（癌基因及相关基因国家重点实验室），上海 200127

研究海绵共生真菌绿木霉（CMB-TN16）的次级代谢产物及其肿瘤细胞毒活性。利用硅胶柱色谱、半制备液相色谱等现代色谱技术方法进行分离纯化，结合核磁共振和质谱等现代谱学手段鉴定化合物结构，同时通过体外MTT法测定化合物的肿瘤细胞毒活性。从海绵共生真菌绿木霉醋酸乙酯提取物中分离得到7个倍半萜类化合物，分别鉴定为二绿木霉烯醇H（1）、二绿木霉烯醇D（2）、二绿木霉烯醇G（3）、黏埽霉酸（4）、(＋)-氢化萜烯七脂酸（5）、(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸A（6）和木聚酸D（7）。化合物1体外对人大细胞肺癌NCI-H460细胞、人骨髓瘤NCI-H929细胞及人结肠癌SW620细胞的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分别为11.8、7.7和13.5 μmol/L。化合物1为新化合物，对以上3株肿瘤细胞具有一定的细胞毒活性。

海绵；绿木霉；倍半萜；抗肿瘤；细胞毒活性；二绿木霉烯醇H；(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸

由于海洋微生物生存环境的特殊性，其生态系统的高压、高盐、低氧、低温、无光照等特点，形成了有别于陆地微生物的独特的新陈代谢途径、生存繁殖方式、适应机制，造就了海洋微生物更为丰富多样、结构新颖特殊且活性显著的天然代谢产物[1-3]。近年来，海洋微生物来源的天然产物得到研究人员的广泛关注，为先导化合物的发现和结构优化、海洋创新药物及海洋中药的研究及开发等创造有利条件，海洋微生物来源天然产物已成为新药研发先导化合物的重要宝库和主要来源[4-6]。

海绵资源是研究共附生微生物的重要资源之一，越来越多的证据揭示海绵共附生微生物是其宿主中很多次级代谢产物的真正生产者，也成为当前国内外海洋新药开发的研究热点[7-9]。课题组从中国南海的海绵sp.中获得其1株木霉属共生微生物绿木霉-CMB-TN16。文献研究表明，海洋中的木霉属真菌含有丰富的萜类、聚酮、肽类等，其中萜类是其特征性成分且具有细胞毒、抗病原菌、抗菌、杀虫等多种生物活性而受到广泛关注[10-11]。课题组前期肿瘤细胞毒活性筛选发现1株中国南海海绵共生菌绿木霉CMB-TN16醋酸提取物体外具有一定的肿瘤细胞毒活性，为了更深入地研究绿木霉CMB-TN16的特征性次级代谢产物，对其醋酸乙酯中潜在的抗肿瘤活性化学成分进行研究，并分离得到7个倍半萜类化合物（图1），分别鉴定为二绿木霉烯醇H（divirensol H，1)、二绿木霉烯醇D（divirensol D，2）、二绿木霉烯醇G（divirensol G，3）、黏埽霉酸（gliocladic acid，4）、(＋)-氢化萜烯七脂酸（hydroheptelidic acid，5）、(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸（3--acetylheptelidic acid A，6）和木聚酸D（xylaric acid D，7）。同时，对所得化合物进行了体外抗肿瘤细胞活性筛选，以期发现具有抗肿瘤活性的化合物，为其后期的进一步研究提供基础。

图1 化合物1～7的结构

1 仪器与材料

1.1 仪器

Bruker-AVANCE600 NMR核磁共振仪（瑞士Bruker公司），赛默飞LTQ液质离子阱质谱仪液质联用仪（赛默飞公司），Chirascan CD圆二色谱仪（英国应用光物理公司），高效液相色谱用岛津液相色谱LC-16系统，配置SPD-16检测器和YMC柱（ODS，250 mm×2.5 mm，5 μm，日本岛津公司），薄层色谱硅胶板GF254（青岛海洋化工厂），Sephadex LH-20凝胶柱填料（Healthcare公司），柱色谱硅胶粉200～300目（青岛海洋化工厂），所用试剂为分析纯（西陇科学股份有限公司）或色谱纯（天津康科德科技有限公司），DMEM和RPMI Medium 1640培养基、胎牛血清、胰酶溶液、PBS均购自美国Gibco公司，人大细胞肺癌NCI-H460细胞、人骨髓瘤NCI-H929细胞及人结肠癌SW620细胞购自中国科学院细胞生物学研究所细胞库。楝酰胺（批号64166）购自Med⁃ChemExpress 公司。

1.2 真菌来源与发酵

从中国南海海域的海绵sp.样品中分离得到的菌株CMB-TN16，经ITS测序鉴定为木霉属真菌绿木霉。将菌株接种于PDA液体培养基中，在28 ℃、180 r/min的摇床上培养7 d；然后切成1 cm×1 cm的小块作为种子进行发酵，接种于10×1 L的大米培养基中，室温静置培养30 d。

2 提取与分离

在室温下，用醋酸乙酯提取所得培养物，直到醋酸乙酯相变为无色或浅色。有机相通过滤纸滤过，蒸发干燥，得到粗提取物。粗提取物（7.2 g）经正相硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）为流动相梯度洗脱，得15个流份（Fr. A～O）。根据UPLC-MS分析所得流分中的化学成分，对可能含有特征性倍半萜成分的流分Fr. D和Fr. I开展进一步深入的分离纯化。Fr. D（67.1 mg）经半制备高效液相色谱，以57% 乙腈-水（3.0 mL/min）等度洗脱，得到化合物1（2.5 mg，R16.0 min）和3（8.8 mg，R＝23.0 min）。对Fr. I（1.78 g）进行反相固相色谱（GracePure C18-Max，从石油醚-醋酸乙酯-甲醇4∶5∶1开始梯度洗脱（梯度变化：甲醇含量为10%、20%、40%、60%、80%、100%）洗脱，得到10个亚组分Fr. I1～I10。Fr. I7（88.7 mg）经半制备高效液相色谱46%乙腈-水等度洗脱（3.0 mL/min）分离纯化得到化合物2（9.8 mg，R＝13.0 min）。Fr. I8（88.7 mg）经半制备高效液相色谱48%乙腈-水等度洗脱（3.0 mL/min）分离纯化，得到化合物4（4.4 mg，R＝24.0 min）、5（8.2 mg，R＝28.0 min）、6（1.6 mg，R＝30.0 min）和7（1.1 mg，R＝33.0 min）。

3 结构鉴定

表1 化合物1的1H-和13C-NMR数据(600/150 MHz, CD3OD)

Table 1 1H- and 13C-NMR data of compound 1 (600/150 MHz, CD3OD)

碳位δHδC碳位δHδC 1 167.31' 167.3 2 133.72' 133.7 34.32 (t, J = 8.4 Hz)56.73'4.28 (d, J = 12.0 Hz), 4.15 (d, J = 12.0 Hz)56.7 46.51 (d, J = 10.8 Hz)145.74'6.71 (d, J = 10.8 Hz)145.2 52.70 (d, J = 9.6 Hz)40.75'2.92 (m)40.8 62.58 (d, J = 11.4 Hz)58.66'2.14 (d, J = 11.4 Hz)52.8 7 72.37' 75.4 82.29 (d, J = 12.6 Hz), 1.43 (m)35.08'1.78 (m), 2.02 (d, J = 13.8 Hz)31.9 91.67 (m), 1.27 (m)20.99'1.64 (m), 1.26 (m)21.1 101.36 (m)46.810'1.38 (m)46.8 111.75 (m)28.611'1.75 (m)28.5 120.93 (d, J = 7.2 Hz)20.612'0.77 (d, J = 6.6 Hz)15.0 130.81 (d, J = 6.6 Hz)15.113'0.97 (d, J = 6.6 Hz)20.9 144.61 (d, J = 12.0 Hz), 4.41 (d, J = 12.0 Hz)75.414'4.47 (d, J = 9.6 Hz), 4.07 (d, J = 9.6 Hz)75.4 15 173.915' 173.9

化合物1的相对构型由偶合常数和NOESY谱判断。在NOESY谱中，H-5与H-11，H-5与H-11存在相关，表明H-5/H-10和H-5′/H-10′构型；H2β-14与H2β-9/H-5存在NOESY相关，H2α-14′与H2β-9′/H-5′存在NOESY相关，结合偶合常数5,6= 11.4 Hz，5′,6′= 11.4 Hz，表明C-5/C-10、C-5′/C-10′为椅式构型与H-5/H-5′、H-6/H-6′、H-10/H-10′和H2-14/H2-14′轴向方向。考虑其生物合成途径，化合物1与二绿木霉烯醇C具有一致的绝对构型。为了进一步确定其绝对构型，参考该类化合物的生物合成途径以及在 B3LYP/6-31 G (d) 基组水平的计算ECD图谱与化合物1的实验图谱一致（图3），确定其绝对构型为5,6,7,10,5,6, 7,10-1。经文献检索，确定该化合物为新化合物，命名为二绿木霉烯醇H（divirensol H）。

图2 化合物1的关键1H-1H COSY和HMBC相关

图3 化合物1的实测和计算ECD谱图

4 活性测试

采用MTT法[14]，以楝酰胺为阳性对照药，测定化合物1～7对NCI-H460、NCI-H929及SW620细胞的细胞毒活性。实验结果（表2）表明，化合物1对以上3株肿瘤细胞均具有一定的细胞毒活性，其半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值分别为11.8、7.7、13.5 μmol/L；化合物2～7对以上3株肿瘤细胞毒活性较弱。

表2 化合物1～7对3株肿瘤细胞毒活性

Table2 Cytotoxic activities of compounds 1—7 against three tumor cell lines

化合物IC50/(μmol·L−1)NCI-H460NCI-H929SW620 111.8±1.7 7.7±0.213.5±0.6 2＞3220.2±0.9＞32 3＞32＞32＞32 420.9±0.118.2±0.6＞32 5＞32＞3220.9±0.3 619.6±0.8＞3222.2±0.3 7＞3221.2±1.118.4±0.8 楝酰胺 3.9±0.6 1.2±0.2 2.8±0.3

5 讨论

海绵是已知生物中最复杂的生物共生体，是研究共附生微生物的重要资源之一。海绵来源真菌因其代谢途径复杂，能够产生结构新颖、活性强烈的代谢产物，这为药物先导化合物提供了多种可能，成为当前国内外研究的热点。本研究从我国南海海绵共生菌株绿木霉CMB-TN16的发酵物中分离得到7个倍半萜类化合物（1～7），其中化合物1为新颖结构的倍半萜，且具有一定的肿瘤细胞毒活性，进一步丰富了海洋真菌木霉次级代谢产物结构的多样性，并为抗肿瘤先导化合物的研究提供了参考和基础数据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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A new sesquiterpenoid from, a marine sponge symbioticsp. fungus

ZHANG Lu1, 2, LIU Chen-peng1, WANG Rui-qi1, JIAO Wei-hua2, ZHANG Xiao-po1

1. School of Pharmaceutical Science, Hainan Medical University, Haikou 571199, China 2. State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, Department of Pharmacy, Research Center for Marine Drugs, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China

To study the secondary metabolites of a marine sponge symbiotic fungusCMB-TN16 and their antitumor cytotoxic activity.The compounds were isolated and purified from EtOAc extract of CMB-TN16 by modern chromatography techniques, such as silica gel column chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography, and their chemical structures were identified by NMR and MS spectrometry. Meanwhile, the antitumor cytotoxic activity of these compounds was evaluated by MTT method.Seven sesquiterpenoids were isolated from the EtOAc extract of CMB-TN16, and identified as divirensol H (1), divirensol D (2), divirensol G (3), gliocladic acid (4), hydroheptelidic acid (5), 3--acetylheptelidic acid A (6) and xylaric acid D (7), respectively. The IC50values of compound 1 against NCI-H460, NCI-H929 and SW620 were 11.8, 7.7, and 13.5 μmol/L, respectively.Compound 1 is a new compound, and have exhibited moderate cytotoxic activities against three tumor cell lines.

marine sponge;; sesquiterpenoid; antitumor; cytotoxic activity; divirensol H; 3--acetylheptelidic acid A

R284.1

A

0253 - 2670(2023)18- 5840 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.002

2023-05-14

海南省科技重大专项（ZDKJ2021036）

张 璐，女，硕士研究生，主要从事天然药物化学研究。Tel: (0898)66893826 E-mail: 714091691@qq.com

张小坡，男，教授，博士生导师，主要研究方向为天然药物化学。Tel: (0898)66893826 E-mail: z_xp1412@163.com

[责任编辑 王文倩]