基于网络药理学与分子对接技术探讨乌梅-僵蚕治疗小儿腺样体肥大的机制

刘灵娟，周泽霖，张鹏，苏浩东，董秀兰

1. 广州中医药大学，广东 广州 510405；2. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

小儿腺样体肥大（AH）是由于反复或慢性炎症刺激导致的腺样体病理性增大，同时也是儿童阻塞性睡眠呼吸暂停综合征发生的常见危险因素[1]。儿童和青少年患病率达34.46%[2]。腺样体作为低年龄组儿童重要的免疫器官，6 岁以内患儿切除将影响其免疫功能[3]，且仍有13%～29%的患儿出现术后残余或复发睡眠时打鼾，这一比例在肥胖患儿中高达73%[4]。

中医药治疗AH 疗效显著，未见明显不良反应[5]。临床研究显示，中药组治疗AH 总有效率高于西药组，且复发率较低，具有良好的治疗效果[6]。乌梅-僵蚕药对出自宋代医家严用和《严氏济生方》中的乌梅丸，临床上被广泛用于治疗多部位的息肉性疾病[7]。究其根本病机多为血瘀痰凝，聚而成痰核、癥瘕，变生恶肉。朱丹溪提出：“自气成积，自积成痰，痰挟瘀血，遂成窠囊。”中医论治AH 也往往从痰、瘀等角度入手[8]，治疗以调理肺脾、化痰散瘀为主。沈中卫等[9]发现，济生乌梅丸能降低大肠息肉内镜治疗后的复发率，具有较强的抗异常增生作用。乌梅、僵蚕均肝经之药，主疏泄，利于气机畅达、血和津布。本研究将网络药理学与分子对接技术相结合，对乌梅-僵蚕药对治疗AH 的潜在机制进行研究，以期指导临床用药并为后续科学研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 乌梅、僵蚕活性成分及靶点信息获取 运用中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）数据库获取乌梅靶点信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为条件，筛选出主要生物活性成分及对应靶点，并查阅既往文献以进一步补充。通过检索文献及运用BATMAN-TCM、HERB 数据库获取TCMSP 数据库中未收录的僵蚕的活性成分，通过PubChem 数据库得到相关成分的SDF 结构，将获取的三维结构导入Swiss Target Prediction 数据库获得相关靶点。利用UniProt 数据库将靶点蛋白转换为标准的gene symbol。

1.2 AH 疾病靶点获取及乌梅-僵蚕药对潜在作用靶点预测 以“Adenoidal hypertrophy”为检索词，查找GeneCards、OMIM 数据库获取AH 的相应靶点，合并取重复值。将与AH 发病相关的靶点和药物活性成分对应的靶点取交集，得到乌梅-僵蚕作用于AH 的潜在治疗靶点。运用R 语言绘制韦恩图，Cytoscape3.7.0 描绘“乌梅-僵蚕药对-活性成分-AH”网络图。

1.3 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选 将交集靶点导入STRING 数据库，物种类型为“Homo sapiens”，最小蛋白相互作用阈值设定为最高可信度（0.900），隐藏孤立蛋白后得到交集靶点蛋白互作（PPI）信息，将PPI 信息输入Cytoscape3.7.0，建立PPI 网络，并对网络拓扑结构进行分析，筛选出网络中作为核心目标的、度值高于中位数2 倍的目标蛋白。

1.4 乌梅-僵蚕治疗AH 网络组建 建立“活性成分-潜在治疗靶点-AH”的对应关系，并导入Cytoscape3.7.0 中，绘制得到“乌梅-僵蚕”治疗AH网络图。

1.5 GO 功能与KEGG 通路富集分析 借助Metascape数据库对潜在治疗靶点进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，pvalue Cutoff 设为0.01，对GO 富集条目按照P进行排序，P越小表示富集程度越高，分别选取BP、CC、MF 中排名前10 的条目绘制条形图，并将富集得到的显著性排名前10 的信号通路（P＜0.01）进行展示。通过R 语言对相关数据进行分析并制作直方图和KEGG 气泡图。

1.6 分子对接 从RSCBPDB 数据库下载PPI 网络中相互作用的核心蛋白的pdb 结构，并从PubChem数据库下载活性小分子的3D 结构。应用PyMOL 和AutoDockTools1.5.7 进行分子对接，计算药物活性成分与靶蛋白相结合所需的最低结合能，获得复合体的相互作用结构。结果以结合能的高低作为化合物结合程度的评价标准，一般化合物分子与受体结合能量越低，构象越稳定，发生的作用可能性则越大，其对接结果越可靠。最终，运用PyMOL 对结果进行可视化操作，用R 语言将分子对接结果绘制热图。

2 结果

2.1 乌梅、僵蚕活性成分及靶点信息获取 见表1、图1。基于文献和各数据库，共筛选得到乌梅活性成分8 个，僵蚕活性成分22 个，活性成分对应的作用靶点539 个及乌梅-僵蚕主要成分靶点网络。

图1 乌梅-僵蚕主要成分靶点网络

表1 乌梅-僵蚕主要活性成分

2.2 乌梅-僵蚕药对治疗AH 潜在作用靶点预测 见图2。AH 对应的相关靶点共1 013 个，与2.1 中得到的539 个乌梅、僵蚕活性成分相关靶点取交集，得到潜在治疗靶点165 个。

图2 乌梅-僵蚕与AH 交集靶点韦恩图

2.3 PPI 网络创建及核心靶点筛选 见图3、表2。PPI 网络中包含154 个节点，973 条边，图中节点颜色深浅和大小与degree 值有关，颜色越深，节点越大，其degree 越大，代表该节点在网络中的地位越重要。该网络中超过度值2 倍中位数的靶点蛋白有27 个，考虑为“乌梅-僵蚕”治疗AH 起主要作用的核心靶点。

图3 潜在作用靶点PPI 网络示意图

表2 乌梅-僵蚕药对治疗AH 核心靶点

2.4 关键活性成分获取 见图4。构建“活性成分-潜在治疗靶点-AH”的对应关系，借助Cytoscape3.7.0得到乌梅僵蚕治疗AH 网络图。网络由547 条边和193 个节点（包含2 个为药物节点，25 个活性成分节点，165 个靶点和1 个为疾病节点）组成。槲皮素（C）、蜕皮素（JC8）、山奈酚（B）是度值排名前3 的化学成分。

图4 活性成分-潜在治疗靶点-AH 网络图

2.5 GO 功能富集分析 见图5。获得差异具有统计学意义（P＜0.01）的GO 功能富集条目，包含生物过程（BP）2 188 条，主要参与对激素的反应、对无机物质的反应、对肽的反应等过程。分子功能（MF）3 478 条，包括癌症的通路、胃泌素信号通路、白细胞介素-4和白细胞介素-13 信号传导等。细胞组分（CC）92 条，主要包括膜筏、膜微域、质膜小窝等。

图5 GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 见图6。KEGG 分析提示，165 个交集靶点共涉及到200 条信号通路，对前10 条通路进行可视化处理，包括癌症的通路、C 型凝集素受体信号通路、Th17 细胞分化通路等关键通路。

图6 KEGG 通路富集分析

2.7 分子对接 见图7～8。为了阐明“乌梅-僵蚕”治疗AH 的潜在分子机制，选取PPI 网络中度值排名前3 位的核心靶点TP53、STAT3、SRC、MAPK3作为受体，度值排名前3 位的活性成分槲皮素、蜕皮素、山奈酚作为配体。当配体与受体结合时，二者结合能越低，构象越稳定，相互作用的可能性越大。分子对接中，槲皮素、蜕皮素分别与STAT3、TP53 的对接结合能均小于-7 kJ/mol，具有较好的结合活性（图7）。为分析活性成分与核心靶点的相互作用关系，利用PyMOL 对对接最佳构象进行可视化（图8）。

图7 主要活性成分与核心靶点的结合能

3 讨论

AH 在中医学上属于痰核、鼻窒、鼾眠的范畴。《本草求真》：“乌梅……入于死肌恶肉、恶痣则除。”乌梅酸涩而温，敛肺化瘀，既能化痔消息肉，又能收伏恶肉，为僵蚕破痰瘀起到“欲散先收”的作用。僵蚕归肝、肺经，色白，五行属金，金曰从革，遇结无不能开。僵蚕不仅可以散痰结，还可以消瘀滞，兼顾风、痰、瘀等病机。《医学入门》：“僵蚕辛咸散痰结，中风喉痹疮瘢灭。”可见其消散之力峻。二者一收一散，长于化痰散结，是临床治疗小儿AH 的核心药对。

网络药理学结果显示，槲皮素、蜕皮素、山奈酚等为乌梅-僵蚕治疗AH 的核心成分。流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌是儿童AH 的菌群分布中3 种主要的条件致病菌[10]。槲皮素通过抑制Akt 磷酸化降低流感嗜血杆菌气道上皮侵袭，并降低细菌诱导的促炎标志物的表达，对流感嗜血杆菌有杀菌作用[11]。在一项关于慢性扁桃体炎患者氧化应激状态的研究中，AH 的另一刺激因素为脂质过氧化[12]。大量文献报道槲皮素可以对抗自由基，减轻氧化应激反应，抑制脂质过氧化[13]。蜕皮素是一种常见的蜕皮类固醇，可以通过核激素受体复合物直接或通过蜕皮素诱导的转录因子驱动靶基因的表达，来控制凋亡和自噬[14]。山奈酚能够有效干扰STAT3 转录激活，抑制炎症细胞功能和促炎细胞因子进一步激活和趋化因子的表达[15]。过敏原刺激是导致AH 的原因之一[16]。嗜酸性粒细胞（EOS）水平在AH 患儿组织和外周血液中的浸润是变态反应发生的具体表现，变态反应因素Th1/Th2 相关细胞因子INF-γ/IL-4分泌失衡使腺样体组织可能存在局部变态反应，增加AH 的发病风险[17]。山奈酚抑制T 细胞产生INF-γ和IL-2，使TH1/TH2 平衡向Th2 表型偏移，用于治疗细胞介导的免疫性疾病[18]。

PPI 网络显示，乌梅-僵蚕可能作用于MAPK3、STAT3、TP53、SRC 等核心靶点对AH 起治疗作用。丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）是细胞促增生和传递应激信号的关键激酶，参与调节炎症介质的表达。Xue XC 等[19]调研发现69%的AH 中国患儿腺样体组织中存在EB 病毒感染[20]。槲皮素可以抑制EB 病毒感染诱导的信号转导和转录激活因子3（STAT3）的活化，减少白细胞介素-6 和活性氧等重要分子，起到抗增殖作用[21]。山奈酚通过抑制SRC 激酶活性降低环氧化酶COX-2 的表达，是有效的抗氧化剂和抗炎剂[22]。尚未有研究表明SRC 与AH 有关，但有研究报道，SRC 与细胞增殖、血管形成、侵袭和转移有关。

GO 功能和KEGG 通路富集分析结果一致，提示乌梅-僵蚕药对治疗AH 主要涉及癌症的通路、C 型凝集素受体信号通路、Th17 细胞分化通路等关键通路。在病理形态上，长期增殖的腺样体内部血管丰富，表面凹凸不平，周围组织之间无纤维包膜，与肿瘤组织的特征表现出一定的相似性[23]。山奈酚对各种类型的癌症具有有效抗增殖和促凋亡活性，其机制与其能够阻滞细胞周期、影响MEK/EK 和STAT3等多种信号通路、抑制血管形成和诱导细胞凋亡有关[24]，与AH 的生物学机制密切相关。C 型凝集素受体（CLRs）可诱导各类炎症因子和趋化因子的表达，并能通过调节花生四烯酸代谢，产生具有免疫调节功能的脂质。CTLs 在颗粒细胞中的表达可能影响对病毒感染的吞噬作用。此外，CTLs 亦参与多种细菌如肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌感染的免疫调控[25]。由于腺样体机械性阻塞、细菌刺激、免疫失调、变态反应等原因，分泌性中耳炎（OME）、变应性鼻炎与AH 常常伴随发病[26]。研究发现，伴鼻窦炎、AH 或腺样体炎、变应性鼻炎的OME 患者CLRs mRNA 表达水平明显高于不伴以上情况的患者。CLRs 可能在OME 中发挥免疫反应的作用[27]。20-羟基蜕皮素和非甾体类蜕皮素激动剂能够调控血细胞和脂肪体中CTLs mRNA 的表达，以及血细胞和血淋巴血浆中CTLs 的表达[28]。Th17 细胞是一群具有潜在促炎功能的CD4+T 细胞，在AH 患儿外周血及腺样体局部Th17/Treg 均升高，与腺样体肥大程度相关[29]，并且腺样体局部Th17/Treg 失衡导致鼻咽部肺炎链球菌的携带增加。槲皮素通过恢复Th17/Treg 平衡和激活血红素加氧酶1 介导的抗炎作用抑制炎症[30]。

分子对接结果表明，槲皮素、蜕皮素与STAT3、TP53 的对接结合能均小于-7 kJ/mol，提示有良好的对接活性。此外，除山奈酚与MAPK3 外，其余化合物分子与受体结合能均小于-6 kJ/mol，表现出较稳定的结合能力，验证了乌梅-僵蚕的有效成分与AH 疾病核心靶点蛋白之间良好的亲和力。

基于网络药理学和分子对接技术，发现乌梅-僵蚕治疗AH 的分子机制可能是槲皮素、蜕皮素、山奈酚等活性成分通过MAPK3、STAT3、TP53、SRC 等潜在作用靶点，经过癌症的通路、C 型凝集素受体信号通路、Th17 细胞分化通路等信号通路，发挥抗炎、免疫、抗氧化、促凋亡和抑制血管生成等作用，后期将进行深入的机制研究，以期为临床药物研发和防治小儿AH 提供较科学的理论基础。