荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC对利福平、异烟肼耐药性的价值分析

温晓萍

【摘要】  目的    探讨荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌复合菌群（MTBC）对利福平、异烟肼耐药性的价值。方法    回顾性分析2018年6月—2021年4月惠州市职业病防治院收治的528例肺结核与耐多药结核病患者的临床资料。所有患者均进行痰液标本采集，采集后进行送检，之后进行分离培养和药敏试验，采用荧光PCR探针熔解曲线法对MTBC对利福平、异烟肼的耐药性进行测定分析，最终获得211份阳性菌株，再经鉴定为MTBC 208份，3份为非结核分枝杆菌。对荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC耐药性的效能进行分析。结果    经比例法进行的药敏试验结果显示，208份MTBC菌种标本中，120份对利福平具有耐药性，146例对异烟肼具有耐药性；经荧光PCR探针熔解曲线法检查后，135份对利福平耐药，敏感73份，其中仅有114份确定对利福平具有耐药性；经荧光PCR探针熔解曲线法检查后，134份对异烟肼耐药，敏感74份，其中有131份确定对异烟肼具有耐药性。荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC对利福平、异烟肼耐药性的特异度分别为76.14%，95.16%，对异烟肼耐药性的检测特异度高于利福平，差异具备统计学意义（P<0.05）；对异烟肼耐药性的检测灵敏度低于利福平，准确度高于利福平，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论    荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC耐药性的效能较高，可应用于快速发现耐药基因位点突变，筛查耐多药肺结核，并在治疗中进行动态监测，进而可指导临床调整治疗方案。

【关键词】  结核分枝杆菌复合菌群； 荧光聚合酶链式反应； 探针熔解曲线法； 利福平； 异烟肼； 耐药性

中图分类号：R446        文献标识码：A

文章编号：1672-1721（2023）16-0101-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.16.034

临床中结核病属于一种多发疾病，其主要是因为感染结核分枝杆菌导致，为严重威胁人类健康的传染性疾病。结核病的主要传播途径为飞沫传染，在人口密集大、人口流动大的公共场所中极易传播，所以积防治结核病具有十分重要的意义。临床呼吸内科中，重症结核病属于一种常见疾病，具有较高的发生率和病死率，需及时采取有效的治疗措施，从而降低患者的病死率。结核病主要经呼吸道飞沫传播所致，主要症状包括咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困难、长期午后潮热等，部分患者会有倦怠乏力、盗汗、食欲减退和体重减轻等症状[1]。结核分枝杆菌包括麻风分枝杆菌、非结核分枝杆菌、结核分枝杆菌复合菌群（MTBC），其中MTBC又包含人型结核分枝杆菌、鼠型分枝杆菌、牛型分枝杆菌等，MTBC可侵犯整个身体的各个器官，以肺部最为多见[2]。由于目前我国的结核病感染者数量较多，且发病率、病死率及耐药率均处于较高水平。因此，探究MTBC对各类结核病的常用药，如利福平、异烟肼的耐药性，对于结核病的防治具有深远意义[3]。荧光聚合酶链式反应（PCR）探针熔解曲线法可快速检测出MTBC的药敏结果，具有较高的操作灵活性[4]。本研究旨在探讨荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC对利福平、异烟肼耐药性的价值，报道如下。

1    资料与方法

1.1    一般资料    回顾性分析2018年6月—2021年4月惠州市职业病防治院收治的528例肺结核与耐多药结核病患者的临床资料，男289例，女239例，年龄31～67岁，平均年龄（44.67±5.91）岁。诊断标准：以《临床诊疗指南·结核病分册》[5]中的相關诊断标准作为参照。纳入标准：满足上述诊断标准者；非精神疾病，可进行正常沟通；无严重心、肝等功能异常等。排除标准：合并脑肿瘤者；依从性差者；存在免疫功能障碍者；存在造血系统功能异常者；对研究所用药物过敏者等。

1.2    方法    所有患者均进行痰液标本采集，采集后进行送检，严格按照《全国临床检验操作规程》[6]进行分离培养。使用至善全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行菌种鉴定及药敏试验。使用比例法检测MTBC对利福平、异烟肼的耐药性，并按照2004年美国临床和实验室标准化委员会药敏试验判断标准进行药敏试验；参照抗微生物药物敏感性试验执行标准推荐的筛选试验和确证试验进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检测，所用质控菌株均采购自原卫生部临床检验中心。之后采用荧光PCR探针溶解曲线法MTBC对利福平、异烟肼的耐药性进行测定分析，最终获得211份阳性菌株，再经鉴定为MTBC 208份，3份为非结核分枝杆菌。

1.3    观察指标    （1）荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC对利福平、异烟肼的耐药性结果。（2）荧光PCR探针熔解曲线法与金标准的检出结果比较，其中金标准为比例法药敏试验。（3）荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC耐药性的效能，包括特异度=真敏感例数/（假耐药+真敏感）例数×100%，灵敏度=真耐药例数/（真耐药+假敏感）例数×100%，准确度=（真耐药+真敏感）例数/总例数×100%。

1.4    统计学方法    使用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计数资料以百分比表示，采用χ²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2    结果

2.1    荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC对利福平、异烟肼的耐药性结果    经比例法进行的药敏试验结果显示，208份MTBC菌种标本中，120份对利福平具有耐药性，146份对异烟肼具有耐药性。经荧光PCR探针熔解曲线法检查后，135份对利福平耐药，敏感73份，其中仅有114份确定对利福平具有耐药性；经荧光PCR探针熔解曲线法检查后，134份对异烟肼耐药，敏感74份，其中有131份确定对异烟肼具有耐药性，见表1。

2.2    荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC耐药性的效能    荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC对利福平、异烟肼耐药性的特异度分别为76.14%，95.16%，对异烟肼耐药性的检测特异度高于利福平，差异具备统计学意义（P<0.05）；对异烟肼耐药性的检测灵敏度低于利福平，准确度高于利福平，但差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

3    讨论

结核病是由于结核杆菌感染人体所导致，根据感染部位的不同，可分为肺结核、淋巴结核、骨骼结核，且肾脏等其他部位也有可能感染结核[7]。具体而言，结核杆菌会入侵人体多个脏器官，其中肺部为主要累及部位，所以通常将其称之为肺结核。肺结核以青年人为主要高发人群，具有慢性和缓发传染病的特点，四季均可能发病，潜伏期在4～8周之间，除了感染肺部外，还可能感染骨骼、皮肤、肠、腹膜、脑膜以及颈淋巴等[7]。人和人之间的传播方式主要为呼吸道传染，传染源是接触到已经被感染的肺结核患者。近几年来，随着环境污染问题的日益严重和艾滋病传播率上升等多种因素的影响，结核病的发生率呈现出逐年上升趋势。结核病的临床表现以呼吸系统症状为主，如咳嗽、咯血等，同时伴随全身症状，如乏力、低热等。抗结核药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇等[8-9]，但随着抗结核药物的使用，有耐药性的结核病患者数量逐渐增加。当患者同时至少对两种一线抗结核药物——利福平和异烟肼均出现耐药性，即被称为耐多药结核病[10]。传统MTBC耐药性的检测方法为绝对浓度法，不仅操作繁琐、耗时较长，同时对菌株分离培养的速度慢，进而影响对MTBC耐药性的诊断结果[11]。

荧光PCR探针熔解曲线法是目前广泛应用于食源性致病菌检测的方法，是一种体外核酸扩增技术，以DNA为模板，在体外合适条件下和耐热DNA聚合酶作用下，對人工合成的寡核苷酸为引物进行特异性扩增目的DNA片段。传统方法检测致病菌检出限仅为104 cfu/mL，而大多数PCR体系的检出限可达到10～104 cfu/mL，具有较高的灵敏度[12]。本研究结果显示，经比例法进行的药敏试验结果显示，208份MTBC菌种标本中，120份对利福平具有耐药性，146例对异烟肼具有耐药性。经荧光PCR探针熔解曲线法检查后，135份对利福平耐药，敏感73份，其中有114份确定对利福平具有耐药性；经荧光PCR探针熔解曲线法检查后，134份对异烟肼耐药，敏感74份，其中有131份确定对异烟肼具有耐药性。荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC对利福平、异烟肼耐药性的特异度分别为76.14%，95.16%，对异烟肼耐药性的检测特异度高于利福平，差异具备统计学意义（P<0.05）；对异烟肼耐药性的检测灵敏度低于利福平，准确度高于利福平，但差异均无统计学意义（P>0.05）。分析原因可能为：在MTBC对异烟肼的耐药性检测中，可覆盖接近90%的异烟肼耐药性菌株，要多于利福平，与郭红革等[13]研究结论相符。

综上所述，经荧光PCR探针熔解曲线法检测MTBC耐药性的效能较高，可应用于快速发现耐药基因位点突变，筛查耐多药肺结核，并在治疗中进行动态监测，进而可指导临床调整治疗方案。但本研究未对敏感结核分枝杆菌菌株进行检测，且未明确有无外源性再感染情况发生，还需进行多中心的深入研究。

参考文献

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[13]    郭红革，李佩珠.荧光PCR探针熔解曲线法评价结核分枝杆菌复合群对利福平和异烟肼耐药性的价值[J].深圳中西医结合杂志，2021，31（10）：46-48.

（收稿日期：2023-03-11）