灵芝产漆酶工艺优化

马亚萍，文 武，暴霆杰，刘民昌，刘 洋，张荣亚，李 力，何玲英，曾正蓉，杨小琴，张 艇

（1.四川中烟工业有限责任公司技术中心，四川 成都 610066；2.卷烟减害降焦四川省重点实验室，四川 成都 610066）

木质素广泛分布于植物的细胞壁中，是一种结构复杂的有机高分子化合物[1]，在木本植物细胞壁中，木质素含量为20%~35%，在草本植物细胞壁中，木质素含量为15%~25%[2]。其结构复杂，不易降解，极大地限制了生物质资源的生产[3]，并且燃烧时产生刺激性、木质气，每年有5 亿~ 6 亿t 未得到充分利用[4]，有数十万吨的烟梗被废弃，对环境造成了严重的污染，对生物质资源产生了极大浪费。漆酶是一种分布广泛的多酚氧化酶，以分子氧作为最终电子受体，是重要的木质纤维降解酶之一，在生物质能源、染料脱色、生物漂白、食品加工、污水处理等领域有深远的应用前景[5]。

与细菌、植物产的漆酶相比，真菌产的漆酶具有更高的金属离子耐受性、热稳定性和底物催化氧化性[6]。灵芝属于白腐真菌，能产生包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶，具有真菌产漆酶良好的酶学特性，在工农业、环境领域和科研工作中受到了广泛的关注。柴新义等人[7]从11 株野生大型真菌中筛选出有柄树舌灵芝具有较高的产漆酶活性。谢玉清等人[8]优化无柄灵芝菌培养基，发现配方为干酪素质量浓度25 g/L、麦麸质量浓度15 g/L、葡萄糖质量浓度10 g/L 和酒石酸铵质量浓度6 g/L，相应的菌漆酶活性达到15 800 U/L。李彩联等人[9]开展白腐菌固态发酵产酶发酵条件优化，以麸皮为发酵基质，接种量5%，发酵120 h 时漆酶活性最大。于建军等人[10]采用响应面法优化漆酶降解梗丝木质素工艺，显著改善香气质、香气量、余味和刺激性。但前人研究一般试验设计较为简单或者试验酶活较低，通过单因素试验设计选出最佳碳氮源，通过Plackett-burman 试验筛选出影响显著的因素，结合最陡爬坡试验，最后采用Box-behnken 中心组合试验得到最优发酵工艺条件，在此条件下获得的漆酶酶活显著提高，大大提高烟梗处理水平，减少烟梗废弃化处理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

1.1.1 菌种

灵芝菌（Ganoderma lucidum） 本实验室保藏。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖水（生物试剂），海博生物公司提供；葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4、维B1、NaOH、柠檬酸、K2HPO4（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、玉米浆（生物试剂），国药集团化学试剂有限公司提供；麸皮（食品级），山东省青岛市面粉加工厂提供。

PDB 培养基：马铃薯葡萄糖水质量浓度26.1 g/L，pH 值自然，于121 ℃下灭菌15 min；

原始发酵培养基：葡萄糖质量浓度20 g/L，酵母粉质量浓度5 g/L，蛋白胨质量浓度10 g/L，MgSO4·7H2O 质量浓度1 g/L，KH2PO4质量浓度1 g/L，维B1质量浓度0.1 g/L，pH 值自然，于121 ℃灭菌15 min。

1.1.3 仪器与设备

FD100A 型高压灭菌锅，致微仪器有限公司产品；BCM-1000A 型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；ZQWY-200V 型卧式全温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司产品；1810 型紫外分光光度计，上海普析产品；JE3002GE 型电子天平，梅特勒产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养方法

（1） 菌液制备。将250 mL 三角瓶中装入50 mL PDB 培养基，从平板上挑取3~4 个菌饼接种于50 mL PDB 培养基中，于30 ℃下以转速150 r/min 培养5 d，用玻璃珠打散菌丝体备用。

（2） 摇瓶发酵培养。配制50 mL 发酵培养基盛放于250 mL 锥形瓶中，加入3 mL 培养好的菌液至发酵培养基中，于30 ℃下以转速180 r/min 培养5 d，测定发酵液漆酶酶活力。

1.2.2 漆酶酶活力测定方法

酶活测定方法为：3 mL 反应体系里含有浓度为2 mmoL/L 的ABTS 溶液0.5 mL、浓度为0.05 moL/L且pH 值为3 的磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液2 mL 和粗酶液（发酵液过0.22 μm 微孔滤膜） 0.5 mL，于45 ℃下反应5 min，测定OD420。

式中：ε——系数，值为3.6×104，L/（mol·cm）；

V总——漆酶酶活测定反应体系总体积，mL；

V酶——添加酶液体积，mL；

Δt——反应时间，min。

每组试验平行培养3 瓶，每瓶发酵液平行测量3 次漆酶酶活力，取平均值。

1.2.3 单因素试验筛选氮源、碳源、烟梗粉末

（1） 培养基氮源的优化。以原始培养基为基础，分别以玉米浆、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨为氮源，添加质量浓度为10，15，20，25 g/L，按菌液体积的6%接种量接种同一瓶菌液，摇瓶培养120 h，测定发酵液漆酶酶活力。

（2） 培养基碳源的优化。以原始培养基为基础，分别以葡萄糖、麸皮、蔗糖、淀粉为碳源，添加质量浓度为5，10，15，20 g/L，按6%的菌液接种量接种同一瓶菌液，摇瓶培养120 h，测定发酵液漆酶酶活力。

（3） 烟梗粉末的优化。以原始培养基为基础，产酶诱导因子烟梗粉末添加质量浓度分别设置为0，5，10，15 g/L，按6%的菌液接种量接种同一瓶菌液，摇瓶培养120 h，测定发酵液漆酶酶活力。

1.2.4 Plackett- burman 试验

根据前期单因素预试验结果，选取玉米浆为氮源、麸皮为碳源，考查酵母浸粉（2 g/L 和3 g/L）、玉米浆（20 g/L和30 g/L）、烟梗粉末（10 g/L和15 g/L）、KH2PO4（1 g/L 和1.5 g/L）、MgSO4·7H2O（1 g/L 和1.5 g/L）、麸皮（30 g/L 和45 g/L）、维B1（0.1 g/L 和0.15 g/L）、接种量（6%和9%）、转速（140 r/min 和200 r/min）、pH 值（3.8 和5.7） 共10 个因素，设1 个虚拟变量。

Plackett-burman 试验的因素和水平见表1。

表1 Plackett-burman 试验的因素和水平

1.2.5 最陡爬坡试验设计

按照一定梯度设置KH2PO4、转速、pH 值，通过测定漆酶酶活，进而确定最优量。

1.2.6 Box- behnken 响应面法优化

在1.2.5 节试验结果的基础上，以KH2PO4、转速、pH 值为自变量，设计三因素三水平试验。

1.2.7 发酵时间的优化

在上述发酵条件下，测定不同发酵时间下的发酵液漆酶酶活，确定较优发酵时间。

1.2.8 灵芝发酵液处理烟梗

采用上述优化好的灵芝发酵液，按烟梗质量分数的5%，10%，15%，20%，25%均匀喷洒到烟梗中，另外均匀喷洒水，使得烟梗最终含水率达到35%，密封好放入50 ℃的恒温培养箱中，处理6 h，80 ℃烘2 h，按照国标YC/T 347-2010 测定样品的木质素含量。

1.2.9 数据处理

采用Design Expert 12 开展试验设计和结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验筛选氮源、碳源、烟梗粉末

2.1.1 碳源筛选

培养基氮源筛选见图1。

图1 培养基氮源筛选

原始发酵培养基分别添加了玉米浆、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨之后的发酵液酶活，由图1 可知，氮源∶玉米浆>大豆蛋白胨>牛肉膏蛋白胨，且玉米浆质量浓度20 g/L 时，酶活最高。因此，选用玉米浆作为碳源，质量浓度20 g/L。因为玉米浆中香草酸和阿魏酸是有效的产漆酶促进剂[11-12]。

2.1.2 碳源的优化

培养基碳源筛选见图2。

图2 培养基碳源筛选

原始发酵培养基分别添加了葡萄糖、麸皮、蔗糖、淀粉之后的发酵液酶活，由图2 可知，碳源∶蔗糖、淀粉>麸皮>葡萄糖，但是以蔗糖、淀粉为碳源时，灵芝菌丝体固形物含量高，接近糊状。因此，优选麸皮作为培养基的碳源。

2.1.3 产酶诱导因子的优化

烟梗中含有丰富的纤维素，并且成本低、易获取，因此采用烟梗粉末作为灵芝产漆酶诱导因子。

灵芝产漆酶随烟梗粉末质量浓度的变化见图3。

图3 灵芝产漆酶随烟梗粉末质量浓度的变化

由图3 可知，0~5 g/L，漆酶酶活快速增加，5~10 g/L，增加放缓，10~15 g/L，趋于平稳。当添加10 g/L的烟梗粉末时，漆酶酶活增加到对照组的1.59 倍。

2.2 Plackett-burman 试验设计结果

通过Plackett-burman 试验，筛选出对灵芝产酶的关键因素。

Plackett-burman 试验结果见表2，Plackett-burman 试验方差分析结果见表3。

表2 Plackett-burman 试验结果

由表2 ~表3 可知，结果显著（p<0.05），确定系数0.98，说明模型有较高的拟合度和可靠性。其中，KH2PO4（p<0.05）、转速（p<0.05）、pH 值（p<0.01） 这3 个因素对漆酶酶活存在显著影响。试验发现，所有pH 值5.7 的发酵液均染菌，酶活较低，可能是因为pH 值5.7 的发酵液不适合灵芝菌的生长，导致培养过程中杂菌生长，与陈建军等人[13]的研究结果一致。

选取KH2PO4、转速、pH 值为主要影响因素，继续优化其水平。对其余因素，因其影响不显著，根据正负效应，确定各组分的质量浓度为酵母浸粉3 g/L，玉米浆20 g/L，烟梗粉末10 g/L，MgSO4·7H2O 1.04 g/L，麸皮31.6 g/L，维B10.1 g/L，接种量6%。

2.3 最陡爬坡试验

选取KH2PO41 g/L，转速150 r/min，pH 值3.8，依次按一定的步长向下试验。

最陡爬坡试验结果见表4。

由表4 可知，随着KH2PO4、转速、pH 值的减小，酶活力依次降低。因此，以试验组1 为下一步试验中心点。

2.4 Box-behnken 响应面试验结果

在Plackett-burman 试验和最陡爬坡试验的基础上，选取A：KH2PO4、B：转速、C：pH 值进一步做Box-behnken 响应面优化，A（-1：0.85 g/L，1：1.15 g/L）、B（-1：130 r/min，1：170 r/min）、C（-1：3.2，1：4.4）。

Box-behnken 试验的因素与水平设计见表5，Box-behnken 响应面试验结果见表6。

表5 Box-behnken 试验的因素与水平设计

表6 Box-behnken 响应面试验结果

通过Design Expert 11 软件进行响应面分析，得到各因素对漆酶酶活影响的二次多项式回归方程：

Box-behnken 方差分析见表7。

表7 Box-behnken 方差分析

由表7 可知，p<0.05，且失拟项不显著（p>0.05），表明模型显著且具有较好的拟合度，响应面模型的信噪比大于4，说明模型设计合理，可信度高[14]，可用模型对灵芝产漆酶进行分析和预判。KH2PO4和转速一次项极显著，pH 值显著，依据p值显著性各因素影响排序为KH2PO4>转速> pH 值。

2.5 各因素相互作用和响应面分析

KH2PO4和转速对漆酶酶活的等高线图和响应面图见图4，KH2PO4和pH 值对漆酶酶活的等高线图和响应面图见图5，转速和pH 值对漆酶酶活的等高线图和响应面图见图6。

图4 KH2PO4 和转速对漆酶酶活的等高线图和响应面图

图5 KH2PO4 和pH 值对漆酶酶活的等高线图和响应面图

图6 转速和pH 值对漆酶酶活的等高线图和响应面图

通过软件Design Expert 11 分析，确定最佳培养基为KH2PO41.1 g/L，转速165 r/min，pH 值3.8，相应响应面二次模型预测漆酶酶活最大值为63 824 U/L。

按照优化后的条件培养120 h，平行测定3 次取平均值，得到漆酶酶活为65 387 U/L，与理论预测值误差2.4%，证明响应面法模型较准确地拟合了实际情况，证明了模型的可靠性。

2.6 发酵时间优化结果

灵芝产漆酶随发酵时间的变化见图7。

图7 灵芝产漆酶随发酵时间的变化

由图7 可知，前48 h 漆酶酶活很低，48 h 后开始增长，在112~125 h 漆酶酶活达到最大，之后开始降低。因此，优选发酵时间112~125 h 作为发酵最佳时间。

2.7 灵芝发酵液降解木质素试验

烟梗木质素降解率随灵芝发酵液添加量的变化见图8。

图8 烟梗木质素降解率随灵芝发酵液添加量的变化

由图8 可知，添加量为5%~10%时，烟梗木质素降解率随添加量的增大而快速增大，发酵液添加量为10%，烟梗木质素降解率达到38%，之后增加发酵液添加量，木质素降解率缓慢增大至趋于平衡，最大可降解42%左右。灵芝发酵液富含漆酶，漆酶可降解木质素，说明灵芝发酵液在降解废弃生物质方面可发挥极大的作用。

3 结论

通过Plackett-burman、最陡爬坡、Box-behnken对灵芝产漆酶发酵条件进行先“定性”、后“定量”的研究方式[15]。首先，通过Plackett-burman 设计从酵母浸粉、玉米浆、烟梗粉末、KH2PO4、MgSO4·7H2O、麸皮、维B1、接种量、转速、pH 值共10 个因素中筛选出KH2PO4、转速、pH 值这3 个对灵芝产漆酶有显著影响的因素；其次，最陡爬坡试验确定最优发酵条件大致范围；最后，通过Box-behnken 响应面试验建立这3 个因素与漆酶产量的回归模型，确定发酵最优条件是酵母浸粉3 g/L，玉米浆20 g/L，烟梗粉末10 g/L，KH2PO41.1 g/L，MgSO4·7H2O 1.04 g/L，麸皮31.6 g/L，维B10.1 g/L，接种量6%，转速165 r/min，pH值3.8，此时发酵液酶活活可达65 387 U/L，以此发酵液添加量10%，木质素降解率可达38%。这种研究方式适合因素多的试验，先找出影响显著的因素，进而逼近最优区域。