响应面法优化油茶叶功能酒制备工艺

谭万红，邓爱华，王 云，危 婷，谢 鹏，刘大宏

（1.湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000；2.湖南泥头山油茶开发有限公司，湖南 常德 415700）

近年来，由于保健型功能酒具有增强药物疗效的作用而引起研究者的关注[1]。据《中华本草》 记载，山茶科植物油茶（Camellia oleifera Abel） 的叶片具有治疗疮疽、鼻衄和皮肤瘙痒等多种功效[1]。现代研究表明，油茶叶含有多种活性成分，如多糖、多酚、蛋白及黄酮类等[2]，具有抑制癌细胞生长、降血糖、抗血栓及提高免疫力[3-4]等功效。研究发现，用50%的乙醇水溶液提取的油茶叶提取物富含黄酮类化合物，预防雄性激素依赖性疾病效果较好[5]。此外，蜂蜜常用来改善配制酒的口感及品质[6]。为此，通过响应面设计试验优化料液比、浸泡时间、浸泡温度、蜂蜜添加量和冰糖添加量等参数，获得高品质油茶叶功能酒的制备工艺，为油茶叶功能酒的开发提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

新鲜油茶叶，湖南泥头山油茶开发有限公司提供；芦丁（>99%），中国药品生物制品检定所提供；52°清香型白酒（食品级），北京前门酿酒厂提供；蜂蜜（食品级），南昌清之峰食品有限公司提供；冰糖（食品级），湖南多来蜜食品制造厂提供；氢氧化钠、乙醇、亚硝酸、硝酸铝，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 试验仪器

UV-1600 型紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海） 有限公司产品；LGJ-10 型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂产品；DZKW-S-6 型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司产品；EX225D 型分析天平，美国奥豪斯仪器有限公司产品；YB-700A 型高速多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司产品；SHZ-DⅢ型循环水真空泵，巩义市予华仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 标准曲线的绘制

参考文献[7]报道方法，进行适当修改。称取100.0 mg 芦丁溶于体积分数60%的乙醇中，用250 mL 容量瓶定容，得到质量浓度为0.4 mg/mL 的芦丁标准液。吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 标准液分别装入25 mL 容量瓶中，用体积分数30%的乙醇溶液补充到10 mL，加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液1.0 mL 摇匀，5 min 后加1.0 mL 的10%硝酸铝溶液摇匀，5 min 后加质量分数为4%的氢氧化钠溶液10.0 mL 摇匀，用体积分数30%的乙醇溶液定容，放置15 min。于波长510 nm 处测定其吸光度，试剂空白为参比液，绘制标准曲线及回归方程。

2.2 单因素试验设计

以感官评价和黄酮含量为品质评价指标，取5 份相同质量的油茶叶冻干粉，采用浸泡法配制油茶叶功能酒，分别考查料液比（1∶50，1∶100，1∶150，1∶200，1∶250 g/mL）、浸泡时间（1，6，12，18，24 h）、浸泡温度（25，35，45，55，65 ℃）、蜂蜜添加量（1%，2%，3%，4%，5%）、冰糖添加量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%） 5 个因素对油茶叶功能酒品质的的影响；单因素试验时，设定其他参数为料液比1∶150（g∶mL），浸泡时间12 h，浸泡温度35 ℃，蜂蜜添加量1%，冰糖添加量0.8%。

2.3 响应面试验设计

根据单因素试验结果，设定浸泡温度45 ℃，以料液比（A）、浸泡时间（B）、蜂蜜添加量（C） 和冰糖添加量（D） 作为自变量，油茶叶功能酒感官评分（Y） 为因变量，根据Box-behnken 中心组合设计原理，设计响应面法试验方案。

各试验因素与水平设计见表1。

表1 各试验因素与水平设计

2.4 油茶叶黄酮含量计算

取油茶叶功能酒待测液1 mL 于具塞试管中，加入体积分数为30%的乙醇溶液4 mL、质量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL。摇匀放置5 min，再加质量分数为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min，加入质量分数为4%的氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，用体积分数30%的乙醇溶液补充至10 mL。用分光光度计于波长510 nm 处测定吸光度。根据标准曲线方程计算油茶叶提取物中黄酮的质量浓度，根据式（1） 计算黄酮得率（Y）。

式中：M1——油茶叶功能酒中黄酮的质量，mg；

V——油茶叶功能酒的体积，mL。

2.5 感官评价方法

参考文献[8]设计油茶叶功能酒的感官评价。挑选20 名经过培训的感官评价员从油茶叶功能酒的色泽、澄清度、香气、滋味、风格5 个方面依照表2的评定标准进行感官评价。

表2 响应面试验设计及结果

表2 油茶叶功能酒感官评价

油茶叶功能酒感官评价见表2。

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的绘制

以吸光度（Y） 为纵坐标，质量浓度（X） 为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=0.01X+0.007 2，相关系数R2=0.999 6。说明在16~80 μg/mL 的质量浓度范围里芦丁质量浓度同吸光度线的线性关系良好。

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

3.2 单因素试验

3.2.1 料液比对油茶叶功能酒品质的影响

料液比对油茶叶功能酒品质的影响见图2。

图2 料液比对油茶叶功能酒品质的影响

由图2 可知，当料液比低于1∶150（g∶mL）时，油茶叶功能酒中黄酮含量及感官评分随料液比的增加而增加；继续增大料液比，黄酮含量及感官评分出现下降趋势，酒的口感偏淡，最适料液比为1∶150（g∶mL） 左右。

3.2.2 浸泡时间对油茶叶功能酒品质的影响

浸泡时间对油茶叶功能酒品质的影响见图3。

图3 浸泡时间对油茶叶功能酒品质的影响

由图3 可知，油茶叶功能酒中黄酮含量及感官评分随浸泡时间的延长不断增加；到12 h 后，继续延长浸泡时间，黄酮含量增加较为平缓，感官评分下降；浸泡时间过长，会导致其他可溶性杂质（如色素、胶质等） 的溶出，影响酒的口感，合适的浸泡时间为12 h 左右。

3.2.3 浸泡温度对油茶叶功能酒品质的影响

浸泡温度对油茶叶功能酒品质的影响见图4。

图4 浸泡温度对油茶叶功能酒品质的影响

由图4 可知，适当提高浸泡温度，油茶叶功能酒中黄酮含量及感官评分不断增加；当温度达到45 ℃后，提高浸泡温度对油茶叶黄酮含量影响不明显，而功能酒的口感及色泽评分下降；可能是温度过高导致杂质的溶出以及黄酮结构的破坏，从而影响酒的口感，最适浸泡温度为45 ℃左右。

3.2.4 蜂蜜添加量对油茶叶功能酒品质的影响

蜂蜜添加量对油茶叶功能酒品质的影响见图5。

图5 蜂蜜添加量对油茶叶功能酒品质的影响

由图5 可知，随蜂蜜添加量的增加，油茶叶功能酒中黄酮含量不断下降，可能是添加蜂蜜增加了体系的黏度，不利于黄酮的溶出；功能酒感官评分在2%达到最佳值，适当添加蜂蜜，可以增加酒的风味及口感，综合考虑最适蜂蜜添加量为2%左右。

3.2.5 冰糖添加量对油茶叶功能酒品质的影响

冰糖添加量对油茶叶功能酒品质的影响见图6。

图6 冰糖添加量对油茶叶功能酒品质的影响

由图6 可知，随冰糖添加量的增加，油茶叶功能酒中黄酮含量略有升高，可能是冰糖有助于黄酮的稳定；适当添加冰糖，可以增加酒的风味及消除植物的涩味，综合考虑最适冰糖添加量为1%左右。

3.3 响应面试验

3.3.1 响应面试验设计及结果

响应面试验设计及结果见表2。

3.3.2 回归模型的建立与分析

将表2 试验数据代入Design Expert 8.0 软件进行响应面分析，油茶叶功能酒得分与各变量的响应面回归数学模型：

响应面回归模型方差分析见表3。

表3 响应面回归模型方差分析

由表3 可知，该回归模型极显著（p<0.001），失拟项不显著（p>0.05），说明模型可靠；R2=0.967 3，R2Adj=0.934 6，说明模型与试验值拟合较好；由F值可知，各因素对油茶叶功能酒感官评分影响大小依次为冰糖添加量（D） >浸泡时间（B） >料液比（A） >蜂蜜添加量（C）；一次项B、D，二次项A2、B2、C2和D2对感官评分的影响非常显著（p<0.001）；一次项A对感官评分的影响显著（p<0.05）；各因素两两交互作用对感官评分影响不显著（p>0.05）。

3.3.3 交互作用分析

料液比与浸泡时间交互作用的响应面与等高线见图7，料液比与蜂蜜添加量交互作用的响应面与等高线见图8，料液比与冰糖添加量交互作用的响应面与等高线见图9，浸泡时间与蜂蜜添加量交互作用的响应面与等高线见图10，浸泡时间与冰糖添加量交互作用的响应面与等高线见图11，蜂蜜添加量与冰糖添加量交互作用的响应面与等高线见图12。

图7 料液比与浸泡时间交互作用的响应面与等高线

图11 浸泡时间与冰糖添加量交互作用的响应面与等高线

图12 蜂蜜添加量与冰糖添加量交互作用的响应面与等高线

由图7 ~图12 可知，对比曲面陡峭程度，发现各因素两两交互作用影响不显著（p>0.05），与方差分析结果一致。

3.3.4 最佳制备工艺条件确定

利用Design Expert 8.0 软件由所建立的数学模型进行参数最优分析，得出最佳制备工艺参数为料液比154.23（g∶mL），浸泡时间13.21 h，蜂蜜添加量1.84%，冰糖添加量1.06%，油茶叶功能酒感官评分为92.57 分。考虑到实际操作的方便，选取调整后的最优制备参数为料液比1∶150（g∶mL），浸泡时间13 h，蜂蜜添加量1.8%，冰糖添加量1%，预测油茶叶功能酒感官评分为91.75 分，在此条件下进行3 次验证试验，感官评分为（91.84±0.743） 分，与预测值无显著性差异（p>0.05），说明模型可靠；经检测优化工艺下制备的油茶叶功能酒中黄酮含量为3.74%。

4 结论

油茶叶功能酒的最佳制备工艺参数为料液比1∶150（g∶mL），蜂蜜添加量1.8%，冰糖添加量1%，在45 ℃下浸泡时间13 h，油茶叶功能酒感官评分为（91.84±0.743）分，油茶叶功能酒中黄酮含量为3.74%。为了进一步拓展油茶叶功能酒在提高免疫力、抗肿瘤等功能食品及保健产品方面的应用，可以继续开展油茶叶功能酒质量标准及药理学试验等方面的研究。