油茶叶黄酮超声辅助提取工艺优化

张宁芸，邓爱华，王 云，危 婷，谭万红，刘大宏

（1. 湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000；2. 湖南泥头山油茶开发有限公司，湖南 常德 415700）

据《中华本草》记载，山茶科植物油茶（Camellia oleiferaAbel） 的叶片具有治疗疮疽，鼻衄和皮肤瘙痒等多种功效[1]。现代研究也表明，油茶叶含有多种活性成分，如多糖、多酚、蛋白及茶皂素和黄酮类等[2]，具有抑制癌细胞生长、降血糖、抗血栓及治疗雄性激素依赖性疾病[3]等功效。植物中黄酮的分离工艺主要有低共融溶剂萃取法、离子液体萃取法[8]及超临界流体萃取法[4]等，这些方法存在耗时长、溶剂昂贵或设备投资大，不利于工业化生产应用。基于热效应及空化效应的超声辅助提取技术可以有效弥补这些缺陷，已广泛应用于植物黄酮的提取生产[5]。采用木瓜蛋白酶结合超声波辅助提取油茶叶黄酮，通过响应面法优化油茶叶黄酮提取工艺参数，以期为油茶叶黄酮的工业化生产提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

新鲜油茶叶，湖南泥头山油茶开发有限公司提供；芦丁（>99%），生工生物工程（上海） 股份有限公司提供；木瓜蛋白酶（活性80 万U/g），合肥巴斯夫生物科技公司提供；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯，湖南汇虹试剂有限公司提供。

1.2 试验仪器

Q5200E 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；UV-1600 型紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海） 有限公司产品；LGJ-10 型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂产品；EX225D 型分析天平，美国奥豪斯仪器有限公司产品；YB-700A 型高速多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司产品；SHZ-DⅢ型循环水真空泵，巩义市予华仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 标准曲线的绘制

参考文献[6]报道方法，进行适当修改。称取100.0 mg 芦丁溶于60%的乙醇中，用250 mL 容量瓶定容，得到0.4 mg/mL 芦丁标准液。吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 标准液分别装入25 mL 容量瓶中，用30%乙醇补充到10 mL，加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液1.0 mL 摇匀，5 min 后加质量分数为10%的硝酸铝溶液1.0 mL 摇匀，5 min 后再加质量分数为4%的氢氧化钠溶液10.0 mL 摇匀，用30%乙醇定容，放置15 min。于波长510 nm 处测定其吸光度，试剂空白为参比液，绘制标准曲线及回归方程。

2.2 单因素试验设计

取5 份冻干油茶叶粉各5.0 g，加入设定参数的木瓜蛋白酶乙醇水溶液，固定超声功率240 W，频率40 kHz，考查乙醇体积分数（40%，50%，60%，70%，80%）、超声时间（30，45，60，75，90 min）、超声温度（30，40，50，60，70 ℃）、料液比（1∶10，1∶14，1∶18，1∶22，1∶26）、木瓜蛋白酶添加量（0.8%，1.6%，2.4%，3.4%，4.0%） 和提取次数（1，2，3，4，5 次） 等因素对黄酮得率的影响。考查单个因素影响时，其他参数为乙醇体积分数50%，料液比1∶14（g∶mL），超声时间30 min，超声温度40 ℃，木瓜蛋白酶添加量0.8%下提取1 次。

2.3 响应面试验设计

根据单因素试验结果，设定超声温度50 ℃，料液比1∶22（g∶mL），以乙醇体积分数（A）、超声时间（B） 和木瓜蛋白酶添加量（C） 作为自变量，油茶叶黄酮得率（Y） 为因变量，根据Box-behnken中心组合设计原理，设计响应面法试验方案。

试验因素与水平设计见表1。

2.4 油茶叶黄酮得率计算

移取油茶叶黄酮提取待测液1 mL 于具塞试管中，加入体积分数为30%的乙醇溶液4 mL、质量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL。摇匀放置5 min，再加入质量分数为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min，加入质量分数为4%的氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，用体积分数为30%的乙醇溶液补充至10 mL。用分光光度计于波长510 nm 处测定吸光度值。根据标准曲线方程计算油茶叶提取物中黄酮的质量浓度，根据式（1） 计算黄酮得率（Y）。

式中：M1——提取的油茶叶中黄酮的质量，g；

M——干燥油茶叶粉质量，g。

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的绘制

根据检测结果得出了不同质量浓度的芦丁标准液吸光度，以吸光度（Y） 为纵坐标，质量浓度（X） 为横坐标，绘制标准曲线图1。回归方程为Y=0.010 0X+0.007 2，相关系数R2=0.999 6。说明在16~80 μg/mL 的质量浓度范围里芦丁质量浓度同吸光度的线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线

芦丁标准曲线见图1。

3.2 单因素试验

3.2.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

乙醇体积分数对油茶叶黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对油茶叶黄酮得率的影响

由图2 可知，乙醇体积分数为40%~70%时，黄酮得率呈上升趋势；当乙醇体积分数继续增加，得率不断降低。乙醇体积分数过低，水溶性杂质易溶出，而乙醇体积分数过高，极性降低不利于黄酮的提取，选择合适的乙醇体积分数为70%左右。

3.2.2 超声时间对黄酮得率的影响

超声时间对油茶叶黄酮得率的影响见图3。

图3 超声时间对油茶叶黄酮得率的影响

由图3 可知，超声时间在30~60 min 时，油茶叶黄酮得率呈上升趋势；当超声时间继续增加，得率不断降低；超声波的空化作用导致细胞壁的破裂，有助于黄酮的溶出，也会导致其他可溶性杂质（如蛋白、胶质等） 的溶出，不利于后续分离纯化，合适的超声时间为60 min 左右。

3.2.3 料液比对黄酮得率的影响

料液比对油茶叶黄酮得率的影响见图4。

图4 料液比对油茶叶黄酮得率的影响

由图4 可知，当料液比低于1∶18（g∶mL）时，油茶叶黄酮得率随料液比的增加而增加；继续增大料液比，黄酮得率增加趋势不显著；可能是溶剂体积增大，单位体积的超声效果降低，不利于黄酮的溶出，合适的料液比为1∶18（g∶mL） 左右。

3.2.4 超声温度对黄酮得率的影响

超声温度对油茶叶黄酮得率的影响见图5。

图5 超声温度对油茶叶黄酮得率的影响

由图5 可知，适当提高超声温度，油茶叶黄酮呈现增加的趋势，在超声温度为50 ℃时，油茶叶黄酮得率达到最大值；提高超声温度，有利于黄酮及其他杂质的溶出，也可能导致黄酮结构的破坏，合适的超声温度为50 ℃左右。

3.2.5 木瓜蛋白酶添加量对黄酮得率的影响

木瓜蛋白酶添加量对油茶叶黄酮得率的影响见图6。

图6 木瓜蛋白酶添加量对油茶叶黄酮得率的影响

由图6 可知，适当添加木瓜蛋白酶的量，油茶叶黄酮得率呈现增加的趋势，在木瓜蛋白酶添加量为1.6%时，油茶叶黄酮得率达到最大值；木瓜蛋白酶稳定性好，有助于黄酮的溶出，量太大也可能导致吸附在物料表面，合适的木瓜蛋白酶添加量为1.6%左右。

3.2.6 提取次数对黄酮得率的影响

提取次数对油茶叶黄酮得率的影响见图7。

图7 提取次数对油茶叶黄酮得率的影响

由图7 可知，油茶叶黄酮从细胞壁中扩散至溶液中需要一定的时间，当提取达到3 次时，油茶叶黄酮得率增加趋势不明显，综合考虑操作和经济成本，提取次数为3 次较为合适。

3.3 响应面试验

3.3.1 响应面试验设计及结果

响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

3.3.2 回归模型的建立与分析

将表2 试验数据代入Design Expert 8.0 软件进行响应面分析，油茶叶黄酮得率与各变量的响应面回归数学模型：

响应面回归模型方差分析见表3。

表3 响应面回归模型方差分析

表3 方差分析结果表明，该回归模型非常显著（p<0.01），失拟项不显著（p>0.05），说明模型可靠；R2=0.940 1，R2Adj=0.863 1，说明模型与试验值拟合较好；由F值可知，各因素对油茶叶黄酮得率影响大小依次为超声时间（B） >乙醇体积分数（A） >木瓜蛋白酶添加量（C）；交互项AC和二次项A2对黄酮得率的影响非常显著（p<0.001）；一次项B、交互项AB和二次项B2对黄酮得率的影响显著（p<0.05），说明乙醇体积分数和酶添加量两两交互作用对黄酮得率影响非常显著，乙醇体积分数和超声时间两两交互作用对黄酮得率影响显著。

3.3.3 交互作用分析

乙醇体积分数与超声时间交互作用的响应面与等高线见图8，乙醇体积分数与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线见图9，超声时间与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线见图10。

图8 乙醇体积分数与超声时间交互作用的响应面与等高线

图9 乙醇体积分数与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线

图10 超声时间与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线

对比曲面陡峭程度，发现乙醇体积分数（A） 与超声时间（B） 之间存在显著的交互作用（p<0.05），乙醇体积分数（A） 与木瓜蛋白酶添加量（C） 之间存在非常显著的交互作用（p<0.001），超声时间（B）与酶添加量（C） 之间交互作用不显著（p>0.05），与方差分析结果一致。

3.3.4 最佳提取工艺条件确定

利用Design Expert 8.0 软件由所建立的数学模型进行参数最优分析，得出最佳萃取工艺条件为乙醇体积分数75.1%，超声时间55.69 min，木瓜蛋白酶添加量0.8%，油茶叶黄酮得率为2.840%。考虑到实际操作的方便，选取调整后的最优参数为乙醇体积分数75%，超声时间55 min，木瓜蛋白酶添加量0.8%，预测油茶叶黄酮得率为2.839%。在此条件下进行3 次验证试验，平均得率为（2.837±0.371） %，与预测值无显著性差异（p>0.05），说明模型可靠。

4 结论

超声辅助溶剂法提取油茶叶中黄酮最佳工艺参数为超声功率240 W，频率40 kHz，乙醇体积分数75%，木瓜蛋白酶添加量0.8%，料液比1∶22（g∶mL），超声温度50 ℃，超声时间55 min，油茶叶黄酮平均得率为（2.837±0.371） %。为了进一步拓展油茶叶黄酮在提高免疫力、抗肿瘤等功能食品及保健产品方面的应用，可继续开展油茶叶黄酮纯化工艺及药理学等方面的研究。