鲤鱼的人工孵化及精子的短期保存

■ 文｜广东粤海饲料集团股份有限公司 郑丽明

中国水产科学研究院南海水产研究所 孔德伟 姜松

在水产养殖中，鱼类精子的短期储存是一种简单而广泛使用的技术手段，广泛应用于各种经济和濒危物种的人工繁殖。精子的短期储存是指精子在低温下保存数小时到数天的时间，同时精子保持其运动和受精能力的潜力。然而，精子在贮藏期间会发生表型、生理和遗传或表观遗传的变化，从而影响其受精能力和后代的性能。本文综述了鲤鱼精子短期储存的研究进展，并对影响鲤鱼精子活力和受精能力的因素进行了探讨。

一、鲤鱼的人工孵化

1.精子和卵子的产生

鲤鱼雄性每年每千克体重产生（1.9±0.2）×1012个精子，其中95%以上可以在激素诱导后获得受精活性，精子浓度在15×109-32×109个精子/mL的范围内。研究表明，精子浓度值根据品种的不同而变化更大，平均值在7.9×109-19.6×109个精子/mL之间。雌性具有高繁殖力，每千克体重产10万至30万个卵。人工产卵期间，鲤鱼的生殖力通常较低，雌性生殖力每千克体重产卵数量范围从4.1万到8.6万个不等，卵的直径和重量分别为1.24～1.42毫米和0.86～1.41毫克。产卵数量主要取决于季节、品种、年龄和鱼自身条件等因素。在20～24℃温度范围内，鲤鱼一年可多次排精及产卵。

2.产卵刺激

在繁殖过程中，卵母细胞和精子的最终成熟是由内源或合成激素诱导和同步的。鲤鱼人工孵化的一般方法为：利用鲤鱼垂体诱导精子和排卵，然后采集精子和卵子，卵子和精子的比例是1∶20万；用孵化水活化，20℃搅拌2分钟；去除粘性后，将受精卵转移到适当容器中，20～22℃孵育；孵育72-96h后，将孵化出的幼虫转移到孵化槽中。为了短期储存，将收集的精子用补充剂（110mMNaC l+40mMKCl+2mMCaCl2+1mMMgSO4+10mMTris,pH=8，渗透性310mOsm/kg）稀释后，在有氧条件下保存在冰上（0～2℃），直到进一步使用。

鲤鱼脑垂体（CP）是最常用的刺激最终配子成熟的因子。每毫克片剂含有5～60μg促黄体生成素（LHRH）。将CP溶解在生理盐水（0.9%NaCl）中，并在背鳍基部和侧线之间肌内注射。雌鱼的有效剂量约为3mg/kg。注射过程分两步：首先注射约0.3～0.5mg/kg。首次给药后12h，再次注射约2.5～2.7mg/kg。雄鱼注射量约为0.5～2.0mg/kg。除CP外，鲤鱼孵化场还使用GnRH类似物，包括哺乳动物LHRH-A（D-Ala6-Pro9-NET-mGnRH）和鲑鱼GnRH-A（D-Arg6，Pro9-NET-sGnRH），剂量约为10μg/kg。

3.人工产卵授精

配子成熟后，将亲鱼麻醉，通过朝向尾部的温和腹部按摩将雌性的卵母细胞收集在盘或碗中，然后可以类似地将雄性精液收集并混入卵母细胞。向精子和卵母细胞的混合物中加入适当体积的激活溶液，如孵化水或盐溶液（45mMNaCl、5mMKCl、Tris20mM，pH=8），并用羽毛或厨房刮刀混合1-2分钟，以激活精子活力并确保卵受精。在实验室条件下，通常使用Bürker细胞血细胞计数器计算精子浓度，并使用显微镜通过目视观察控制精子活力。授精的最佳精子稀释度确定为10-2～10-3。研究表明，使用脱氯自来水时，每个卵母细胞的最低精子数可确保良好受精，孵化率范围为8500至25000。受精后，卵子迅速水合和膨胀。因此，应使用含有碱性蛋白酶、全脂奶粉、白色粘土或单宁酸的溶液，在5-60分钟内消除受精卵的粘性。最后将卵在孵化罐（大规模生产）或培养皿、塑料碗或孵化器（实验室）中孵育，直到幼虫孵化。

二、鲤鱼精子的短期储存

精子短期储存一般是将精子稀释到一种叫做“缓冲剂”的溶液或精浆中，使精子在低温（0～2℃）下保持数小时至数天的静止状态。精子短期储存在实际生产和科学研究中具有广泛应用和重要意义。例如，当雄性亲鱼对激素刺激的反应比雌性更快，或者雄性数量有限，或者需要在养鱼场之间运输精子时，精子短期储存就会发挥作用。研究表明，精子在体外储存过程中会发生ATP的成熟和再生，因此短期储存有助于诱导睾丸精子、不良精子或性别逆转精子的成熟。

当使用缓冲剂时，必须将精子以静止状态储存，直到它们用于受精。由于精子在精浆中是不动的，因此精浆中的渗透压是恒定的。在使用缓冲剂的条件下，精子受到保护，免受渗透损伤，并保持鞭毛跳动和受精能力所需的ATP来源。精子储存期间的低温使精子代谢保持在最低水平。然而，如果储存时间延长，微生物污染可能会降低精子的活力和存活率。

三、影响精子短期保存的因素

1.温度

精子与缓冲剂混合物的温度会影响短期储存的成功率。Ravinder等人报道了未稀释的鲤鱼精子在室温（22℃）和低温（2℃）下分别储存20和84小时后完全失去了运动潜能，而在5℃的温度条件下存储84h后，33%的精子仍可被激活，因此，在5℃和2℃之间的温度条件对鲤鱼精子的具体作用机制值得关注。在2℃、5℃和22℃保存后，50%精子失去运动潜能的致死温度（LT50）分别为40h、55h和2.5h。研究表明，低温对于在孵化场短时间储存精子是必要的，就像短期储存在水产养殖中具有重要经济价值的各种物种一样，这是因为低温下精子代谢受到抑制，短期储存的精子轴突跳动所需的ATP无法获得。

2.缓冲剂

缓冲剂的化学成分、渗透性和pH值是短期储存成功的重要因素，这些因素在精子运动信号传导中起到重要的生理作用。缓冲剂可保护精子免受质膜、基因组（DNA和表观基因组）、线粒体和轴突的损伤。因此，精子活力的持续时间比未稀释保存在缓冲剂中的精子延长。

精浆成分的测定有助于优化稀释剂的成分。精浆含有分别负责能量代谢和精子运动信号传导的有机物和离子成分。Na+、K+和Cl-是精浆的主要离子成分，Na+：K+的比例接近1∶1。当NaCl、KCl、葡萄糖或甘露醇的渗透压浓度＜300mOsmol/kg时，鲤鱼精子活力可以被激活，这表明精子活力启动不需要Na+或K+离子。当精子以310mOsmol/kg渗透压浓度储存时，在150mMNaCl中储存24-72h后，精子活力、速度〔曲线速度（VCL）和直线速度（VSL）〕和搏动频率高于150mMKCl。研究显示，在110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgSO4、20mMTris的稀释液中，精子储存效果最佳。

鲤鱼精浆的pH值在7.5～8.5之间。研究表明，当环境渗透压触发精子运动启动时，细胞内的碱性pH值是激活动力蛋白 ATP酶所必需的，其值与细胞外介质（精浆、精浆扩展器或激活介质）的pH值平行变化。用110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgSO4、20mMTris以1:9的比例稀释鲤鱼精子，在pH值为7～9的条件下储存72h，精子的游动百分率、游动速度（VCl或VSL）和跳动频率均无显著差异。研究表明，鲤鱼储存的精子在45mMNaCl、5mMKCl、20mMTris、pH7、pH8和pH9条件下被激活时显示出相似的运动百分比，这表明，中性和碱性pH的缓冲剂均可为精子提供适当的环境，以保护其运动潜能。

四、精子形态、生理生化的短期改变

1.短期储存对精子形态和数量的影响

Saad等人报道了鲤鱼在储存期间异常精子的增加，并利用扫描和透射电镜描述了短期储存精子的几种形态改变，这些变化包括核膜脱离、线粒体受损、鞭毛卷曲、轴突中央二重微管缺失等。在精子短期储存期间，精子运动和速度的降低是由于质膜和线粒体的破坏，而这些质膜和线粒体调控着精子渗透压依赖性的运动启动和ATP依赖性的鞭毛跳动。

研究发现，精子在储存过程中会出现精子数量下降的现象，其下降幅度随稀释比和添加量的不同而不同。体外保存8天后，1∶1稀释的精子数量减少了22.9%，而未稀释的精子数量减少了50.3%。稀释成1∶1的缓冲剂大大延缓了精子浓度的降低。

2.短期储存对精子生理生化的影响

精子质量（鱼龄、产卵季节、光周期条件和精液收集方法）和储存条件（温度、氧气可用性、稀释剂成分、储存时间）是精子短期储存成功的关键。这些因素可以改变精子的结构和功能，导致ROS的产生和DNA碎片的增加。氧气对所有活细胞都至关重要，但其代谢物ROS对精子的运动、速度、新陈代谢、活力丧失和受精潜力等功能有负面影响。在精子储存期间，氧化应激产生ROS，可以损害质膜、线粒体结构和呼吸功能。细胞膜中多不饱和脂肪酸的存在使精子的精浆和核膜成为ROS的极好靶点，同时破坏DNA和蛋白质ROS诱导脂质过氧化，导致细胞膜完整性丧失，增加细胞渗透性、酶失活和抗渗透性休克能力。

线粒体是鱼类精子的主要能量来源，对精子的运动、完整性和受精潜力具有重要作用。鱼类精子运动的激活需要线粒体分泌大量ATP，细胞内ATP含量控制着精子运动期的持续时间。然而，没有足够的证据表明鱼类精子在短期储存过程中，细胞间ATP在线粒体中减少，尽管线粒体的低氧化能力、线粒体膜完整性和线粒体损伤可通过降低细胞间ATP含量来限制精子的运动周期。

五、结论及未来展望

鱼类精子的短期储存是同步人工受精配子可用性、保存高质量精子和改善低质量精子或提高水产养殖中经济重要或濒危鱼类人工繁殖效率的有效手段。在鲤鱼中，精子可以在体外低温下短时间储存。储存时间过长时，精子失去其运动潜力，其活力和ATP降低，并且精子会发生膜或基因组和表观遗传的改变，导致受精能力降低。当短期储存的精子用于受精时，增加精子与卵母细胞的比例可以补偿受精率的下降。