他克莫司对肝移植急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响

林玲，袁梦淑，田小荣，王玉鑫，曹欢，吴龙龙，田轩，左怀文，张新如，宋红丽（.天津医科大学一中心临床学院，天津 009；.南开大学医学院，天津00074；.天津市第一中心医院器官移植科，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 009）

目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效治疗手段，由于供肝的持续短缺，心脏死亡器官捐献（donation after circulatory death，DCD）肝脏被广泛应用于移植手术中［1］。现有的静态冷藏技术作为保存DCD 供肝的方式常导致术后并发症的高风险和高病死率［2］。我们前期研究发现，相较于静态冷保存，常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）可有效缓解DCD 供肝移植过程中的缺血/再灌注损伤［3］。

急性排斥反应是影响移植预后的严重并发症，免疫抑制剂的广泛应用能够有效预防排斥反应的发生，然而与免疫抑制相关的短期和长期风险，如感染、恶性肿瘤、心血管疾病、代谢紊乱及其他并发症也不容忽视［4-5］。肝脏与肠道之间通过胆道、门静脉和体循环紧密连接［6］，因此本研究在使用NMP 系统保存肝脏的基础上，欲探究常用免疫抑制剂他克莫司对于肝移植急性排斥大鼠发挥保护肝脏作用时对肠道菌群的影响，为他克莫司在器官移植领域的安全合理用药提供更充分的指导资料。

1 对象与方法

1.1 实验材料：他克莫司（安斯泰来制药有限公司，沈阳，中国）。雄性Lewis 大鼠12 只，7 ～8 周龄，200 ～220 g 为供体；雄性棕色挪威大鼠（brown norway，BN）大鼠18 只，8 ～9 周龄，220 ～240 g为受体，用于制备大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。以上实验动物由军事医学科学院实验动物中心提供，实验流程遵循实验动物伦理规定，并经天津市第一中心医院伦理委员会许可，批号为2016-03-A1。

1.2 建立 NMP 系统：根据前期研究［7］，NMP 系统由器官腔、膜式氧合器、蠕动泵、温度和压力传感器、过滤器和热交换器组成。灌流液总体积为80 ml，主要成分为60 ml 含20 %胎牛血清和1 %青链霉素混合液的DMEM /F12 培养液、20 ml 大鼠自体全血、肝素（5 U/ml）、地塞米松（2.5 μg/ml）和胰岛素（1 U/ml）。

1.3 大鼠原位肝移植急性排斥模型建立及分组：Lewis 大鼠为供体，BN 大鼠为受体，利用“二袖套”法建立大鼠肝移植手术模型［8］，具体参考文献［9］。实验动物被随机分为3 组：假手术（Sham）组、单纯机械灌注（NMP）组及他克莫司（FMP）组。Sham 组大鼠仅开腹游离肝脏韧带，不阻断肝脏供血，30 min 后关腹。NMP 组供肝仅进行NMP。FMP 组供肝单纯进行NMP，并在移植术后每天以0.1 mg/kg的剂量灌胃。每组6 只，术后14 d 收集血液、肝脏和肠道内容物样本进行检测。

1.4 肝脏病理学：肝脏样本固定24 ～48 h 后进行脱水、石蜡包埋及切片等步骤处理后进行苏木精-伊红 （hematoxylin and eosin，HE）染色，显微镜下观察，按Banff 标准统计排斥活动指数（rejection activity index，RAI），评估组织病理学变化。

1.5 肝功能测定：血液样本在室温下进行离心机离心，3000×g，10 min 后获得血清样本，使用全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和总胆红素（total bilirubin，TBil）的水平。

1.6 粪便16 SrDNA 分析：收集大鼠回盲部肠道内容物，立即浸入液氮冻存，随后存放于-80℃低温冰箱进行保存，密闭无菌便盒收集的盲肠内容物送至北京博奥晶典生物技术有限公司行高通量测序。

1.7 统计学分析：采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，采用成组t 检验或单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NMP 系统和大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立：建立了稳定运行的NMP 系统（图1A）。术后14 d 肝脏组织HE 结果显示：正常大鼠肝脏组织结构完整，未见明显异常（图1B）。而急性排斥反应模型大鼠肝脏汇管区及中央静脉内皮细胞下有炎症细胞浸润（图1C），证明急性排斥反应模型建立成功。

图1 NMP 系统和急性排斥反应大鼠肝脏病理

2.2 他克莫司能够延长DCD 肝移植大鼠的生存期：NMP 组大鼠存活时间最短，NMP 联合术后他克莫司显著延长了大鼠存活时间（图2）。

图2 他克莫司对DCD 肝移植排斥反应大鼠生存率的影响（每组n ＝5）

2.3 他克莫司能够改善肝移植急性排斥大鼠的肝损伤：在Sham 组病理切片中，肝脏组织没有见到淤血、坏死或者炎性表现（图3A），NMP 组血窦和中央静脉淤血表现明显，炎症细胞明显浸润（图3B），FMP 组，肝小叶中没有看到中央静脉淤血或者组织坏死的情况发生（图3C）。计算RAI 结果显示，FMP 组（2.00±1.23）RAI 显著低于NMP 组（7.60 ±1.14），差异有统计学意义（P ＜0.05）（图3D）。结果表明，他克莫司治疗能够显著改善大鼠肝移植排斥损伤模型肝脏病理。

图3 他克莫司对DCD 肝移植排斥反应大鼠肝脏病理和肝功能的影响

与Sham 组相比，NMP 组和FMP 组血清AST、ALT 和TBil 水平均明显上升，但FMP 组较NMP 组，上述指标显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）（图3E ～G）。结果表明，他克莫司可以显著降低肝移植术后肝功能水平，改善移植术后肝脏损伤的血液指标。

2.4 他克莫司对肝移植急性排斥大鼠肠道菌群的影响

2.4.1 物种组成分析：门水平物种组成分析显示（图4A ～B），FMP 组中厚壁菌门比例显著高于NMP 组，变形菌门比例显著低于NMP 组，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。科水平物种组成分析显示（图4C ～F），FMP 组中阿克曼菌科和毛螺菌科比例显著高于NMP 组，梭菌科和脱硫弧菌科显著低于NMP 组，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

图4 他克莫司对DCD 肝移植排斥反应大鼠肠道菌群物种组成的影响

2.4.2 多样性分析：α 多样性分析显示（表1），NMP 组ACE 指 数 和Chao 指 数 均 低 于Sham 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与NMP 组相比，FMP 组Chao 指数降低，差异有统计学意义（P ＜0.05），但两组间ACE 指数、Shannon 指数和Simpson 指数均无显著差异。

表1 各组间OTUs 和α 多样性分析（±s）

表1 各组间OTUs 和α 多样性分析（±s）

分组 OTUs Chao ACE Shannon Simpson Sham 1235.00±210.10 1440.00±209.20 1463.00±221.00 4.23±0.47 0.10±0.06 NMP 985.80±135.40 1119.00±161.70 1143.00±160.60 3.97±0.86 0.09±0.10 FMP 738.30±194.30 803.70±206.50 840.10±224.70 3.96±0.44 0.05±0.02 F 11.053 16.205 13.951 0.356 0.950 P 0.001 0.00 0.00 0.706 0.409

基于主坐标分析（principal component analysis，PCA）展示的β 多样性分析结果显示（图5），FMP组的群落结构不同于Sham 组和NMP 组，并且其中的主成分占总变化的39.13%和16.83%。ANOSIM相似分析证明FMP 组与其他两组间存在显著差异（P ＜0.05）。

图5 他克莫司对DCD 肝移植排斥反应大鼠肠道菌群PCA分析的影响

2.4.3 功能基因在代谢途径变化：通过重建未观察到的状态对群落进行系统发育研究（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt）分析显示（图6），与NMP 组相比，FMP 组富集其他聚糖降解和鞘脂代谢通路，而铁载体类非核糖体肽生物合成通路的富集程度较NMP 组降低。

图6 他克莫司对DCD 肝移植排斥反应大鼠代谢途径的影响

3 讨 论

3.1 肝移植是终末期肝病的唯一有效的治疗方法10］。静态冷保存作为DCD 供肝常用的体外保存方式被发现会增加供肝血流恢复后再灌注损伤的风险［11］。我们的前期研究发现，与静态冷保存相比，NMP 在常温下模拟机体环境，修复大鼠肝脏损伤，且在第14 天时保肝效果显著［12］。移植后排斥反应是导致移植肝功能障碍的主要原因，严重影响患者术后的生存质量和生存率，临床上常用免疫抑制剂来预防并治疗排斥反应［5］。他克莫司是一种抗T细胞药物，是一种在移植术后广泛使用的钙调神经磷酸酶抑制剂［13］。研究发现，在心脏移植后他克莫司的剂量与移植后肠道菌群多样性相互影响［14］，但是目前肝移植后他克莫司的应用与肠道菌群的关系仍无确定证据。

我们的研究发现，他克莫司在显著改善肝移植急性排斥反应大鼠肝损伤的同时，明显降低了术后大鼠的肠道菌群丰度，也对术后大鼠的肠道菌群结构造成了一定的影响。毛螺菌科属于厚壁菌门的梭菌簇X Ⅳa，研究发现，它能够水解淀粉和其他糖类以产生丁酸盐和短链脂肪酸，影响健康功能［15］。阿克曼菌科属于疣微菌门，研究发现，它对葡萄糖代谢和肠道通透性具有有益作用［16］。脱硫弧菌被认为是一种机会性病原体，它产生内毒素并具有将硫酸盐还原为硫化氢的能力，从而破坏肠道屏障［17］。而我们的研究发现，他克莫司能够促进排斥反应后毛螺菌科和阿克曼菌科的比例升高，并且逆转排斥反应后脱硫弧菌比例的升高。

本研究发现应用他克莫司后大鼠富集鞘脂代谢通路。鞘脂是在神经系统中高度富集的一类脂质，主要的生物活性鞘脂包括神经酰胺、神经酰胺1-磷酸酯、葡糖基神经酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇，其中神经酰胺通常抑制细胞增殖并促进凋亡，而1-磷酸鞘氨醇刺激生长并抑制凋亡，具有极大的复杂性和多样性［18-19］。目前，鞘脂代谢途径已成为治疗糖尿病、多发性硬化症和白血病等疾病的生物活性药物开发的重要目标［20］。但是目前还没有针对他克莫司与鞘脂代谢相关性的研究。总之，我们的研究发现他克莫司可以调节肝移植术后大鼠肠道菌群结构和代谢途径，这为我们提供了一种新的思路，如通过检测肠道菌群来监控肝移植术后免疫抑制剂剂量、血药浓度、使用时间及疗效等对患者的影响，为肝移植技术后接受免疫抑制剂治疗的患者病情评估提供了新的检测策略。