巨细胞病毒IgM 抗体检测试纸条的改良与性能评价

陈亨莉

（英科新创（厦门）科技股份有限公司，福建厦门361022）

0 引言

巨细胞病毒是一种疱疹病毒，能引起受感染细胞肿大，主要通过血液、性行为及垂直传播[1]。如果孕妇感染巨细胞病毒，可导致胎儿出现宫内感染，造成流产、早产、死胎或胎儿畸形[2-4]。巨细胞病毒是“优生五项”检查项目中的一项。在我国和其他国家，“优生五项”检查已被列为孕前健康检查的常规检测项目，国内主要通过筛查血清抗体进行积极的预防和控制[5-6]。目前，检测血清抗体的常用方法有胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和化学发光法。ELISA 法手工操作步骤烦琐，检测时间长，不能满足临床快速诊断的要求；化学发光法成本高，对设备和人力有较高要求，在基层卫生单位实施起来有一定难度；而胶体金免疫层析法则简便、快速、检测成本低、无需仪器设备，十几分钟即可用肉眼观察结果，可实现即时检测，在临床筛查检测中被广泛应用。

胶体金免疫层析法虽有众多优点，但其在检测IgM 抗体时存在一定的漏检率，易产生假阴性结果[7]。如样本中含有高效价的病原体特异性IgG 抗体，则病原体IgG 抗体与病原体IgM 抗体会在检测线处竞争病原体抗原结合位点而导致检测结果出现假阴性[8]。为了消除IgG 抗体的干扰，一般采用抗人IgG抗体结合去除样本中的IgG 抗体，该方法多应用于ELISA、化学发光、免疫比浊检测试剂中，在免疫层析试剂中的应用较少。目前可采取的方式是将抗人IgG 抗体加入到标记物垫、滤过垫或样品处理液中[9]。添加至标记物垫或者滤过垫中处理工艺较为烦琐，而添加在样品处理液中常温保存容易造成IgG 抗体失效。鉴于此，为获得更高的检测准确度，本研究对巨细胞病毒IgM 抗体检测试纸条进行改良，将抗人IgG 抗体直接包被于硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上，即在NC 膜的检测线下方设置一条包被有高浓度鼠抗人IgG 抗体的拦截线以结合样本中的干扰IgG 抗体，工艺简单合理、高效方便、可操作性强。

1 试纸条的制备

1.1 材料与试剂

巨细胞病毒重组抗原、鼠抗人IgM 单克隆抗体及鼠抗人IgG 抗体均由北京新创生物工程有限公司提供；NC 膜购自德国Sartorius 公司；玻璃纤维、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板、吸水纸购自上海金标生物科技有限公司。氯金酸、柠檬酸钠、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、碳酸钾（K2CO3）购自美国SIGMA 公司。

1.2 仪器与设备

电热鼓风干燥箱为上海双五金牌；离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；划膜仪和数控切条机购自上海金标生物科技有限公司。

1.3 胶体金标记抗体的制备

1.3.1 胶体金粒径的选择

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金[10]。选择粒径大小约为40 nm 的胶体金，观察胶体金溶液的物理性状，采用分光光度计在波长300～700 nm 范围内进行扫描，测定其最大吸收峰。

（1）增值税的计算和抵扣问题。上文已经提及三种不同的PPP项目付费方式，根据付费方式的不同，增值税的计算方法也不同。譬如，在营改增后，PPP项目增值税计算依旧处于探索实践中，在建设投资问题上的操作方法不同，是否含税的问题对于融资成本影响巨大。智慧城市建设的PPP项目大都集中在轨道交通领域，投资金额巨大，而营改增后建筑业税率上升到10%。所以，怎样取得可抵扣增值税进项税成为项目公司的难题。一旦在建设期内缴纳过高的增值税销项税，会直接降低后期项目建设的资金运用率。而对于某些增值税免征的PPP项目，会出现项目期间增值税无法完全抵扣的问题。

胶体金溶液视觉观察呈清亮的紫红色，溶液上层无漂浮物，底部无黑色聚集物。如图1 所示，胶体金溶液的最大吸收峰在534 nm 处，峰宽较小，表明制备的胶体金溶液颗粒分布均匀，透光性和稳定性良好。

图1 胶体金溶液标记前后紫外-可见光谱图

1.3.2 胶体金标记最适pH 的选定

取7 个1.5 mL 离心管，分别加入1 mL 胶体金溶液，然后依次加入5、6、7、8、9、10、11 μL 0.2 mol/L的K2CO3溶液，混匀。再分别加入10 μg 鼠抗人IgM单克隆抗体，混匀。静置15 min 后，各加入200 μL 10%NaCl 溶液，混匀，静置2 h，用分光光度计测定534 nm 波长处的吸光度值。保持吸光度值变化最小的K2CO3溶液用量为最适pH。

如图2 所示，当0.2 mol/L K2CO3溶液用量在8～11 μL 时其吸光度值只有微小变化，溶液保持紫红色，很稳定。在其他用量时，颗粒出现团聚，溶液颜色变为灰色或紫色。因此，选择在1 mL 胶体金中加入8 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液时为标记最适pH。

图2 不同K2CO3 溶液用量条件下胶体金标记溶液吸光度值的变化

1.3.3 标记抗体最适标记量的选定

取7 个1.5 mL 离心管，分别加入1 mL 胶体金溶液，再各加适量0.2 mol/L K2CO3溶液混匀调至最适pH。体依次加入1、2、5、10、15、20、25 μg 鼠抗人IgM 单克隆抗体，混匀。静置15 min 后，分别加入200 μL 10%NaCl 溶液，混匀。静置2 h 后，用分光光度计测定534 nm 波长处的吸光度值。吸光度值最大处对应的标记量为稳定胶体金的最低抗体量，在此基础上加20%即为最适的抗体标记量。

如图3 所示，标记量小于10 μg 时，胶体金溶液的吸光度值呈上升趋势；标记量大于10 μg 后，胶体金溶液吸光度值略微下降后趋于平缓，溶液颜色无明显变化，表明10 μg 为稳定胶体金的最低抗体量。因此，1 mL 胶体金溶液最适抗体标记量为12 μg（最低抗体量基础上加20%）。

图3 不同抗体标记量的胶体金标记溶液吸光度值的变化

1.3.4 胶体金标记抗体的表征

随着标记过程中胶体金颗粒表面与抗体和BSA的结合，其最大吸收峰会发生移动，由图1 可以看出，胶体金标记鼠抗人IgM 单克隆抗体后，最大吸收峰所在波长由534 nm 移至541 nm，说明胶体金标记成功。

1.4 胶体金垫的制备

1.5 改良NC 膜的制备

沿着层析方向在NC 膜上依次设置IgG 抗体拦截线I、检测线T 及对照线C，如图4 所示。根据前期研究[8]，最终确定拦截线I 上包被的鼠抗人IgG 抗体最佳使用浓度为3.0 mg/mL，检测线T 上包被的巨细胞病毒重组抗原最佳使用浓度为1.5 mg/mL，对照线C 上包被的羊抗鸡IgY 抗体最佳使用浓度为0.5 mg/mL。NC 膜制备完成后在37 ℃下干燥2 h 备用。

图4 改良试纸条NC 膜俯视图

1.6 试剂条的组装

将样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水纸顺次相互搭接粘贴在聚底板上，切割宽度为每条0.4 cm，装入有干燥剂的铝箔袋中密封保存。试纸条实物图如图5 所示。

图5 试纸条实物图

1.7 检测方法及结果读取

检测时，取血清/血浆样本10 μL 或全血样本20 μL 加在试纸条的样品垫上，随后在样品垫上滴加2 滴样本稀释液，静置15～20 min 观察结果。若对照线C 和检测线T 处均出现红色条带，表明样本巨细胞病毒IgM 为阳性；若只有对照线C 处出现红色条带，检测结果为阴性；若对照线C 处未出现红色条带，则说明该试纸条失效。

2 试纸条的性能评价

2.1 材料与仪器

巨细胞病毒IgM 抗体国家参考品购自中国食品药品检定研究院，巨细胞病毒IgM 抗体检测试剂盒（ELISA 法）为某试剂厂家上市产品；样本来自福建医科大学附属协和医院及本公司员工体检样本；酶标仪购自深圳汇松科技发展有限公司。

2.2 方法

2.2.1 干扰IgG 抗体的消除

选取3 份效价分别为1∶320、1∶640、1∶1 280 的巨细胞病毒IgG 抗体阳性且IgM 阴性样本（编号G1～G3）。选取5 份巨细胞病毒IgM 抗体强阳性且IgG阴性样本（编号M1～M5），分别用健康人阴性血清稀释为巨细胞病毒IgM 抗体弱阳性样本（编号M1#～M5#）作为对照组，稀释比例分别为1∶400、1∶128、1∶128、1∶256、1∶200。若IgG 抗体有干扰，其对弱阳血清影响较大，可导致假阴性。将M1～M5 号样本分别用G1～G3号样本按1∶400、1∶128、1∶128、1∶256、1∶200 比例进行稀释，得到的15 份样本编号为MG1～MG15，作为实验组。用制备的设有拦截线的改良试纸条和无拦截线的传统试纸条分别检测实验组和对照组样本。

2.2.2 准确度、最低检出限及重复性

用巨细胞病毒IgM 抗体国家参考品检验制备的改良试纸条的准确度、最低检出限及重复性。其中国家参考品包括5 份阳性参考品（P1～P5）、9 份阴性参考品（N1～N9）、6 份检出限参考品（S1～S6）及1 份重复性参考品。

2.2.3 交叉反应

将10 种相近病原体强阳性样本[弓形虫IgM 抗体（TOX-IgM）、风疹病毒IgM 抗体（RV-IgM）、单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM 抗体（HSV-Ⅰ-IgM）、单纯疱疹病毒Ⅱ型IgM 抗体（HSV-Ⅱ-IgM）、肺炎支原体IgM 抗体（MP-IgM）、副流感病毒IgM 抗体（PIV-IgM）、水痘-带状疱疹病毒IgM 抗体（VZV-IgM）、甲型肝炎病毒IgM 抗体（HAV-IgM）、细小病毒B19 IgM 抗体（PVB19-IgM）、巨细胞病毒IgG 抗体（CMV-IgG）]作为交叉物，用制备的改良试纸条进行检测，研究其交叉反应。

2.2.4 临床评价

用制备的传统试纸条、改良试纸条和ELISA 试剂盒分别对收集的620 份血清同时进行检测，并对其检测结果进行统计学分析，评价试纸条的性能指标及临床应用价值。根据定性检测体外诊断试剂的一般临床试验方案[11]，评价的主要性能指标为敏感度、特异度、总符合率、总符合率95%的置信区间、Kappa 值和约登指数等。其中Kappa 值评估的是检测结果之间的一致性，Kappa 值若≥0.75 说明一致性较好，二者具有较好的等效性[12]。约登指数综合了检测结果的敏感度和特异度信息，值越大，试验方法的真实性越高[13]。约登指数＞0.7，试验结果具有一定的准确性，而≤0.5时则没有诊断价值。

2.3 结果

2.3.1 干扰IgG 抗体的消除

在无拦截线的传统试纸条上进行的实验结果表明，高浓度的巨细胞病毒IgG 抗体会对巨细胞病毒IgM 抗体弱阳性样本的检测结果产生干扰，使检测结果出现假阴性。而在设有拦截线的改良试纸条上进行的实验结果表明，高浓度的巨细胞病毒IgG 抗体对巨细胞病毒IgM 抗体弱阳性样本检测结果未产生影响，可有效结合样本中效价≤1 280 的巨细胞病毒IgG 抗体，从而降低样本中IgG 抗体对检测结果的干扰，提高IgM 抗体检测的准确性。详见表1、2。

表1 对照组样本检测结果

表2 实验组样本检测结果

2.3.2 准确度、最低检出限及重复性

如图6 所示，5 份阳性参考品均清晰显示阳性结果，9 份阴性参考品均显示为阴性结果，说明改良试纸条具有良好的准确性。当检测最低检出限参考品S5 时，检测线仍可显示清晰。用重复性参考品重复检测10 次，显色均一，表明改良试纸条具有较好的重复性。

图6 巨细胞病毒IgM 抗体国家参考品检测结果

2.3.3 交叉反应

如图7 所示，10 份强阳性交叉样本检测结果均为阴性，说明制备的改良试纸条与弓形虫IgM 抗体（TOX-IgM）、风疹病毒IgM 抗体（RV-IgM）、单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM 抗体（HSV-Ⅰ-IgM）、单纯疱疹病毒Ⅱ型IgM 抗体（HSV-Ⅱ-IgM）、肺炎支原体IgM 抗体（MP-IgM）、副流感病毒IgM 抗体（PIV-IgM）、水痘-带状疱疹病毒IgM 抗体（VZV-IgM）、甲型肝炎病毒IgM 抗体（HAV-IgM）、细小病毒B19 IgM 抗体（PVB19-IgM）、巨细胞病毒IgG 抗体（CMV-IgG）均无交叉反应。

图7 交叉反应检测结果

2.3.4 临床评价

在ELISA 试剂盒检出的312 份阳性样本中，传统试纸条检出阳性266 份，阳性检出率为85.3%；改良试纸条检出阳性291 份，阳性检出率为93.3%（见表3），出现假阴性的25 份样本均确认为巨细胞病毒IgG 抗体强阳性。对阳性检出率结果采用配对t检验，P＜0.05，说明配对样本之间差异具有统计学意义。表明改良后的试纸条提高了阳性检出率，改善了假阴性问题，使检测结果更为准确。

表3 传统试纸条与改良试纸条的阳性检出率比较

分析制备的改良试纸条与ELISA 试剂盒的检测结果（见表4）可得出，改良试纸条敏感度为93.3%、特异度为96.8%，与ELISA 试剂盒的总符合率为95.0%，总符合率95%置信区间为93.0%～96.5%。采用Mc-Nemar 进行统计学分析，P=0.071，显示2 种检测方法差异无显著统计学意义（P＞0.05）。Kappa 值为0.907，表明改良试纸条与ELISA 试剂盒具有较高的一致性。约登指数为0.909，说明试验方法真实性好、准确性较高，具有诊断价值。

表4 改良试纸条与ELISA 试剂盒检测结果 单位：份

3 讨论

巨细胞病毒感染者大多无症状或仅表现有轻微症状，多数妇女对此感染了解甚少，常由于忽视而造成不良妊娠后果。因此，加强备孕人群巨细胞病毒感染筛查，以便早期诊断和治疗，对于优生优育具有极其重要的意义。

目前在巨细胞病毒的检测方式中，胶体金免疫层析相比ELISA、化学发光和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法可更加快捷地获得检测结果，对操作人员、设备要求较低，非常适合基层对大批量样本的现场筛查[14]。王丹等[15]的研究显示，胶体金免疫层析法检测巨细胞病毒IgG 抗体和IgM 抗体的阳性率高于化学发光法，可作为巨细胞病毒感染的筛查方法。

胶体金免疫层析法检测一般包括间接法、捕获法、夹心法等，间接法即检测线上包被的为病原体抗原，标记胶体金的为抗人IgM 抗体。采用间接法检测病原体IgM 抗体时，样本中含有的高效价病原体特异性IgG 抗体会使得IgG 抗体与IgM 抗体在检测线处竞争抗原结合位点而导致检测结果出现假阴性。

本研究针对目前胶体金免疫层析法检测IgM 抗体的缺陷，通过优化胶体金标记条件、改良NC 膜结构设计，制备出改良巨细胞病毒IgM 抗体检测试纸条并对其性能进行验证评价。结果表明改良试纸条可去除样本中效价≤1 280 的干扰IgG 抗体，检测国家参考品的准确度、最低检出限及重复性均符合要求，且对10 种相近病原体强阳性样本无交叉反应。临床评价结果显示，改良试纸条可有效改善方法学上的假阴性问题，在ELISA 试剂盒检出的312 份阳性样本中，阳性检出率由传统试条的85.3%提高至93.3%，检测结果更为准确。由改良试纸条与ELISA 试剂盒临床检测结果分析比较得出，改良试纸条具有良好的敏感度（93.3%）和特异度（96.8%），且与ELISA 法具有较高的一致性。

本研究的改良方法可为其他病原体IgM 抗体的检测提供参考。由于目前检测的样本数量有限，后期将收集更多的临床样本，对改良试纸条的性能进行完善。