多孔建筑涂层抗病毒测试方法研究

朱常才，刘蕊蕊，冀志江，赵春艳，王静，解帅，郭春红

（中国建筑材料科学研究总院有限公司 绿色建筑材料国家重点实验室，北京 100024）

0 引 言

建筑内墙涂料对提高居住舒适性及美化室内环境具有重要作用。功能化建筑内墙涂层对控制室内建筑环境有一定的帮助作用，如具有甲醛及VOC 净化功能的涂料和具有抗菌功能的建筑涂层[1-2]。由于新冠疫情的爆发，人们对于建筑涂料的功能又有了新的需求，抗病毒涂料成为研究和关注重点[2-3]，也推动了抗病毒涂料的快速发展。在公共场所，尤其是儿童娱乐场所（如幼儿园、儿童游乐场等）、养老机构和医院等特殊人群聚集场所，人与建筑室内涂层之间的接触不可避免，所以研究抗病毒涂层具有重要的意义。

抗菌涂料的测试方法已经发展了很多年，标准体系已经相对成熟，而抗病毒涂料相关标准的发展相对滞后，我国抗病毒涂料相关标准主要有中国涂料工业协会发布的团体标准T/CNCIA 01014—2020《抗菌及抗病毒涂料》和T/CNCIA 03002—2020《涂料（漆膜）抗病毒性能测试方法》，广东省涂料行业协会发布的团体标准T/GDTL 011—2020《抗菌、抗病毒涂料》，所用病毒均为人类病毒，过程操作困难且对测试条件要求较高。并且未针对涂层孔隙对测试方法进行区分，涂层孔隙的存在对病毒具有吸附作用，抗病毒测试方法的不同可能影响病毒的吸附与脱附，从而影响抗病毒测试结果。国际上较为通用的材料抗病毒测试方法标准有ISO 21702：2019《塑料和其他非多孔表面抗病毒活性的测定》，此标准主要是针对致密无孔表面的抗病毒活性测试，与我国标准类似，所用病毒为人类病毒。除此之外，国际上对于致密表面的抗病毒测试方法标准还包括ISO 18071：2016《精细陶瓷（先进陶瓷、高技术陶瓷）-在室内照明环境下半导体光催化材料的抗病毒活性测定-噬菌体Q-beta 试验法》、ISO 18061：2014《精细陶瓷（先进陶瓷、高技术陶瓷）-半导体光催化材料的抗病毒活性测定-用噬菌体Q-beta 试验法》，这2 项标准所用病毒为噬菌体，噬菌体相比于人类病毒培养操作过程更为简单，且测试条件要求较低，安全性更高。对于多孔材料（织物）表面抗病毒测试方法标准较为通用的为ISO 18184：2019《纺织品-纺织品抗病毒活性评价》，但是此标准不适用于多孔建筑涂层抗病毒测试。由于多孔建筑涂层孔隙的存在对病毒具有吸附作用，在多孔涂层抗病毒测试中除了涂层中抗病毒成分对病毒具有灭活作用，涂层对病毒的吸附同样表现出抗病毒效果。为此研究多孔涂层抗病毒测试中各因素对测试结果的影响，有助于进一步优化多孔建筑涂层抗病毒测试方法，提高测试结果的准确性。

本研究选用天然多孔材料硅藻土为填料，以苯丙乳液为基料制备多孔建筑涂料，选择粒径大小不同的2 种噬菌体MS2（26 nm）和φA039（90 nm）作为非包膜病毒模型，研究了病毒储备液种类、涂层表面病毒悬液滴加量和滴加病毒悬液的浓度对多孔涂层抗病毒测试结果的影响，并探讨了抗病毒测试中应该注意的相关问题。

1 实 验

1.1 主要原材料及仪器设备

煅烧硅藻土：吉林远通矿业有限公司；苯丙乳液：固含量50%，德国巴斯夫；纤维素：250-HBR，亚什兰化工（南京）有限公司；多功能助剂：AMP-95，陶氏化学；乙二醇：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；消泡剂：NXZ 和A10，圣诺普科有限公司；润湿剂：X-100，陶氏化学；分散剂：5040，圣诺普科有限公司；增稠剂：ASE-60，陶氏化学；水：自制去离子水。以上未表明纯度的原材料均为工业级。Luria-Bertani（LB）肉汤、Luria-Bertani（LB）琼脂：北京陆桥技术股份有限公司；营养肉汤、营养琼脂、琼脂粉：北京双旋微生物培养基制品厂；氯化钠（NaCl）：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；SM 缓冲液：北京依塔生物科技有限公司。大肠杆菌噬菌体MS2（ATCC 15597-B1）及其宿主大肠杆菌（ATCC 15597，E.coli）：北纳生物；维氏气单胞菌噬菌体φA039 及其宿主维氏气单胞菌A039：集美大学提供。实验所用仪器设备如表1 所示。

表1 实验仪器设备

1.2 涂层及培养液的制备

多孔建筑涂料的基本质量配比为：水40.50%，纤维素0.15%，多功能助剂0.15%，乙二醇1.30%，消泡剂NXZ 0.20%，消泡剂A10 0.20%，润湿剂0.15%，分散剂1.00%，硅藻土30.00%，苯丙乳液25.70%，增稠剂0.65%。按照配比依次将原材料加入到烧杯中，充分搅拌后过滤出料。

涂层涂覆：抗病毒样品和FE-SEM 测试涂层样品采用机械涂膜的方法，将液态涂料均匀涂覆在普通平板窗户玻璃基底（25 mm×25 mm）表面（见图1），涂覆厚度为500 μm。压汞测试样品采用机械涂膜将涂料均匀负载于聚酯膜表面，涂覆厚度为500 μm，待涂膜干燥后将其裁成10 mm×10 mm 小片测试。涂覆完的涂料样品，在室内环境下干燥7 d 后置于玻璃干燥器中，至少放置7 d 后再进行性能测试。

图1 涂料在玻璃表面涂覆示意

生理盐水：称取4.25 g NaCl 加入去离子水中溶解，然后定容至500 mL 得到浓度为0.85%的生理盐水。半固营养琼脂（0.5%）：将1.8 g 营养肉汤粉和0.5 g 琼脂粉加入100 mL 去离子水中加热溶解。半固LB 琼脂（0.5%）：将2.5 g LB 肉汤粉和0.5 g 琼脂粉加入100 mL 去离子水中加热溶解。1/500 肉汤培养基：取1 mL 肉汤培养基（营养肉汤或LB 肉汤）与500 mL 去离子水混合均匀。其他培养基按产品说明配制，培养基、生理盐水及其他实验所用器皿于121 ℃下高压蒸汽灭菌15 min。

1.3 病毒储备液制备

病毒肉汤储备液制备：噬菌体MS2 和φA039 肉汤储备液根据ISO 18071：2016 制备。噬菌体MS2 和E.coli 用营养肉汤和营养琼脂进行培养，培养温度为37 ℃，摇床培养转速为170 r/min；噬菌体φA039 和维氏气单胞菌A039 用LB 肉汤和LB琼脂培养，培养温度为28 ℃，摇床培养转速为120 r/min。培养的菌液和噬菌体肉汤先在8500 r/min 离心10 min，然后取上清液，用注射过滤器过滤3 次，滤液置于4 ℃冷藏。制备的噬菌体MS2 和φA039 的储备液浓度分别为1×1012、1×109PFU/mL。

病毒SM 缓冲液储备液制备：取培养12 h 的双层琼脂培养基顶层琼脂置于10 mL 聚乙烯离心管中，然后加入2 mL SM 缓冲液，将顶层琼脂于SM 缓冲液中充分分散，置于4 ℃冷藏过夜，过夜后于8500 r/min 离心10 min，取上清液用注射过滤器过滤3 次，滤液置于4 ℃冷藏。制备的噬菌体MS2 和φA039 储备液浓度分别为1×1012、1×109PFU/mL。

1.4 孔隙特征和抗病毒测试方法

根据GB/T 21650.1—2008《压汞法和气体吸附法测定固体材料孔径分布和孔隙度 第1 部分：压汞法》测试涂层孔隙特性；用3D 数字显微镜观察涂层断面形貌，并测试干燥后的涂层厚度；用FE-SEM 对干燥后的建筑涂层表面形貌进行观察，加速电压为20 kV。

建筑多孔涂层抗病毒测试参照薄膜粘附法[4-5]，在此基础上进行了一定的修改。选用MS2 和φA039 作为非包膜病毒模型进行抗病毒测试。测试前将样品置于紫外灯下照射1 h灭菌。用1/500 营养肉汤（MS2）或LB 肉汤（φA039）将噬菌体储备液（肉汤储备液和SM 缓冲液储备液）稀释至特定浓度，各测试条件下病毒稀释浓度见表2。然后取特定量稀释后的噬菌体悬液滴加至样品表面，各测试条件下滴加量见表2。滴加悬液后在样品表面覆透明薄膜，轻轻按压薄膜使噬菌体悬液分布于整个样品表面，覆膜后将样品置于带盖一次性塑料平皿中。最后将装有样品的一次性平皿置于恒温恒湿箱孵育，温湿度设置见表2，分别孵育2、4、8、12 h 后用10 mL 生理盐水（0.85%）冲洗样品表面。再用1 mL 移液枪吸取冲洗液反复冲洗样品表面15 次，并在冲洗液中漂洗覆膜。然后用生理盐水对冲洗液进行梯度稀释。取稀释后的噬菌体悬液100 μL 与100 μL 宿主菌液混合（MS2 感染E.coli，φA039 感染A039），混合均匀后室温静置侵染10 min，然后向侵染后的菌液中加入4 mL 半固琼脂，混合均匀后倒入平板琼脂培养基，制备双层琼脂平板培养基，待双层琼脂平板冷却凝固后将平板置于培养箱中培养（E.coli 培养温度37 ℃，A039 培养温度28 ℃）。双层琼脂平板在培养箱中培养12 h 后计数噬斑。负载病毒样品在恒温恒湿箱中孵育后表面噬菌体MS2 和φA039 回收浓度（N）通过噬斑数量和稀释倍数计算。

表2 影响抗病毒测试各因素测试条件

初始病毒浓度（N0）是将稀释后的噬菌体悬液滴加至玻璃基底表面，覆膜后直接用生理盐水冲洗，稀释后培养计数噬斑，计算0 h 样品表面病毒回收浓度。根据病毒浓度降低的对数值确定病毒灭活量，按Lg（N/N0）确定病毒灭活量。对建筑多孔涂层表面病毒灭活量的评估重复2~3 次，实验中每个样品平行稀释2 组。

2 结果与讨论

2.1 多孔建筑涂层的表征

硅藻土涂层断面数字显微照片、表面SEM 照片和填料堆积模型如图2 所示。

图2 硅藻土涂层的断面数字显微照片、扫描电镜照片和填料堆积模型

由图2（a）可以看出，在低放大倍数下硅藻土涂层表面较为平整，无明显缺陷，通过数字显微镜无法观察到涂层填料微观结构。通过对3~5 张涂层断面显微镜照片进行厚度统计，得到干燥后的硅藻土涂层厚度为（181±8）μm，涂层收缩率较大，为63.77%。由图2（b）、（c）可以看出，涂层表面存在大量孔隙，且涂层中煅烧硅藻土形状各异，既存在长条形颗粒也存在粒径大小不均的块状颗粒，所用硅藻土具有宽的粒径分布。形状及粒径大小分布不均的硅藻土更容易形成堆积孔隙[见图2（d）]。此外，涂层中还有结构较为完整的多孔硅藻土颗粒，能够进一步丰富涂层的孔隙结构。这种多孔结构的存在有助于提高涂层对表面物质的吸附作用，在抗病毒测试中硅藻土涂层表面的多孔结构有助于涂层对病毒的吸附。

对于开孔且孔隙较大的孔结构多以压汞法表征涂层孔隙分布[6-7]。采用压汞法测得硅藻土涂层的孔径分布如图3 所示。

图3 硅藻土涂层的孔径分布

由图3 计算可得，干燥后硅藻土涂层的中值孔径为2.91 μm，孔隙率为34.49%，总孔容为0.38 mL/g。涂层孔径在0.83~11.32 μm，具有宽的孔径分布。由于所选用的煅烧硅藻土为大小不一、形状各异的颗粒，导致在涂料成膜过程中尺寸较大且形状不规则的颗粒容易形成堆积孔隙。此外，尺寸较小且形状较为规则的硅藻土可填充部分较大堆积孔隙，一定程度上加宽了涂层孔径分布。涂层中不规则且大小不一的硅藻土堆积而成的涂层孔隙多为尺寸较大的微米级孔隙，属于大孔孔隙[8]。以硅藻土为填料所制备涂层为大孔径多孔涂层，对提高涂层吸附作用有利，有助于涂层对表面病毒的多重吸附。

2.2 噬菌体储备液种类对多孔涂层抗病毒活性的影响

有机物影响病毒存活时间[9]，多孔硅藻土涂层负载病毒悬液后于低湿度（相对湿度为30%）下孵育，是为了表征在较为苛刻的条件下储备液种类对噬菌体活性的影响。此外，非包膜病毒在低湿度条件下存活时间更短[10-11]，低湿度有助于2 种噬菌体的灭活，这样才能更好地体现储备液种类对涂层表面病毒存活时间的影响。按照表2 将悬浮于SM 缓冲液和肉汤中的噬菌体用1/500 肉汤稀释后用于涂层抗病毒活性测试，不同噬菌体储备液种类对多孔涂层抗病毒活性的影响如图4所示。

图4 不同噬菌体储备液种类对多孔涂层抗病毒活性的影响

由图4 可以看出，相同病毒不同储备液类型测得的多孔涂层的抗病毒活性存在明显差异，此外，多孔硅藻土涂层对2种病毒灭活性也存在差异，多孔硅藻土涂层对噬菌体φA039的灭活量更高。以SM 缓冲液作为储备液测得的多孔涂层表面病毒的灭活量低，说明在SM 缓冲液存在情况下病毒存活时间更久。噬菌体的长期保存方法除了制成干粉外，还经常将噬菌体悬于SM 缓冲液中进行保存[12]。虽然用1/500 肉汤对噬菌体的SM 缓冲液储备液进行了稀释，但是稀释液中依然有缓冲液残留，这有助于病毒的存活。SM 缓冲液中明胶的存在，可能有助于病毒在悬液中的聚集，从而延长病毒存活时间[13-16]。噬菌体肉汤储备液组成与稀释用1/500 肉汤组成相同，可以避免其他物质对噬菌体存活时间的影响，从而使负载在多孔涂层表面的噬菌体的存活时间主要受建筑涂层自身性质影响。综上所述，使用噬菌体肉汤存储液可以有效避免噬菌体悬液成分不同对测试结果的影响，提高多孔建筑涂层抗病毒测试结果的准确性。另外，如果因测试条件要求选用其他类型病毒储备液进行抗病毒活性测试时，要保证对比实验中所用储备液种类相同，以确保测试结果的可靠性。

2.3 病毒悬液滴加量对多孔涂层抗病毒活性的影响（见图5）

图5 病毒悬液滴加量对多孔涂层抗病毒活性的影响

由图5 可以看出，对于噬菌体MS2，多孔硅藻土涂层表面滴加50 μL 病毒悬液时涂层表面病毒灭活量最高，滴加100、150 μL 时涂层表面病毒灭活量大致相同；对于噬菌体φA039，病毒在多孔硅藻土表面的灭活量随着病毒悬液滴加量的增加而降低。多孔建筑涂层对表面滴加的病毒悬液具有 吸附作用，悬液滴加至涂层表面后会有部分病毒随悬液一起进入涂层孔隙内部。吸附于涂层孔隙内部并且无法脱附的病毒最终会因为无宿主可以感染而失活，从而使多孔涂层具备抗病毒特性。对于样品涂层而言，对负载悬液的吸附量有限，当病毒悬液滴加量过多时，涂层表面会附着大量水，可能影响多孔涂层对病毒的吸附，无法有效表征多孔涂层对病毒的吸附量，从而影响测试结果的准确性。另外，当多孔建筑涂层表面噬菌体悬液滴加量过多时（150 μL），悬液极易从覆膜与涂层之间溢出，导致覆膜周边悬液量多于覆膜与涂层之间的悬液量（见图6），这也容易造成大的实验误差。

图6 涂层表面病毒悬液不同滴加量并覆膜后照片（罗丹明B 溶液替代病毒悬液）

综上所述，对于特定大小的多孔建筑涂层测试样品，在抗病毒测试过程中要控制病毒悬液的滴加量，滴加过多会影响多孔涂层对病毒吸附且悬液容易从表面和覆膜之间大量溢出，滴加过少悬液可能会被完全吸附，造成病毒完全灭活的假象。因此，测试中样品表面病毒悬液的滴加量应根据测试样品大小确定，当测试样品大小为25 mm×25 mm 时，样品表面病毒悬液最佳滴加量为50 μL。当测试样品大小改变时，要在正式测试前先确定样品表面病毒悬液的最佳滴加量，以提高测试结果的准确性。

2.4 病毒悬液浓度对多孔涂层抗病毒活性的影响（见图7）

图7 病毒悬液浓度对多孔涂层抗病毒活性的影响

由图7 可以看出，随着病毒在涂层表面孵育时间的延长，2 种病毒回收浓度均降低，但是滴加的病毒悬液初始浓度不同时，涂层的抗病毒测试结果存在明显差异。对于噬菌体MS2，当病毒悬液浓度由1×106PFU/mL 增大至1×109PFU/mL时，涂层表面负载病毒的灭活量呈先升高后降低再升高的趋势，规律性较差，但是滴加不同浓度病毒悬液之间的抗病毒结果差异性明显；对于噬菌体φA039，随着病毒悬液浓度增大，病毒在涂层表面孵育12 h 后病毒灭活量逐渐降低。在细菌灭活实验中已经有研究证实菌液浓度与细菌灭活有关[17-18]，实验结果表明，与细菌实验类似，病毒（噬菌体）浓度与病毒灭活之间也存在一定的关系。因此，在多孔涂层抗病毒测试的多次对比重复实验中，要保证每次实验的病毒悬液初始浓度一致，这样才能保证每次测试结果之间的抗病毒结果具有可对比性。另外，为了减少实验操作误差和工作量，提高实验效率，同时保证测试结果能够有效表征涂层抗病毒活性，所用病毒悬液初始浓度应该控制在一定范围内。悬液浓度过高，测试中从样品表面回收病毒的稀释次数增加，容易造成实验误差，且增加测试工作量；浓度过低，可能不能够充分表征涂层对病毒的灭活量。虽然多孔涂层表面病毒灭活率未达到99.99%，但是涂层中加入抗病毒材料或环境条件变化会使病毒灭活增大，为了确保测试结果能够有效表征涂层抗病毒活性，所用病毒悬液浓度至少应保证最终病毒灭活率达到99.99%[5]。测试结果表明，在多孔建筑涂层抗病毒测试中滴加病毒悬液的最佳浓度为1×107PFU/mL。

3 结 语

（1）病毒储备液种类不同时涂层抗病毒测试结果存在差异，测试中应尽量选用与储备液稀释液成分相同的病毒储备液，以提高多次对比实验测试结果的准确性。

（2）涂层抗病毒测试中，涂层表面滴加稀释后的病毒悬液体积应视测试样品大小而定，以能充分填充涂层与覆膜之间间隙为宜。当样品大小为25 mm×25 mm 时，样品表面病毒悬液最佳滴加量为50 μL，测试样品大小改变时，应重新确定样品表面病毒悬液滴加量。

（3）测试中对于病毒储备液的稀释浓度应控制在一定范围内，并确保对比测试中涂层表面滴加病毒悬液的浓度一致，以减少实验量，为提高对比测试结果的可靠性，储备液最佳稀释浓度为1×107PFU/mL。由此可见，在多孔建筑涂层抗病毒测试中，应尽量避免各种因素变化对测试结果的影响，并且在多次重复和对比测试中应保证各影响因素的一致性，从而提高测试结果的可靠性。