葡萄果实成熟软化机制研究进展※

●朱绍坤 乔 军 马 丽※※

（1.辽宁省果树科学研究所 辽宁 营口 115009；2.辽宁农业职业技术学院 辽宁 营口 115009）

葡萄属于典型的非呼吸跃变型果实[1]。果实软化发生时间比呼吸跃变型果实要早，且由于其为浆果，果实皮薄，汁多，在食用、运输贮存过程中易发生破裂、腐烂等问题。因此，果实软化程度已成为判断鲜食葡萄果实新鲜程度的一个重要指标。随着葡萄果实成熟软化，果实质地发生一系列变化，当前研究普遍认为果实成熟软化是由多种细胞壁水解酶、调节蛋白相互作用引发的。不同葡萄品种间果实质地存在较大差异，脆肉型品种一直备受关注，现已成为重要的育种材料及目标品种[2]。然而造成不同品种间质地差异的机制还不清楚。因此，了解葡萄果实成熟软化调控机制，对于葡萄综合品质改良有着非常重要的意义。本文介绍了葡萄细胞壁中果胶组成及其分子结构，综述了葡萄软化过程中果胶、纤维素和半纤维素等成分的含量变化，归纳了葡萄果实软化时细胞壁降解酶基因表达水平变化，总结了转录组和QTL 定位在果实软化方面的应用进展，以期为葡萄新品种选育及保鲜贮运研究提供参考。

1 果实成熟软化与细胞壁结构和组分关系

软化是果实成熟的主要特征之一，直接影响果品的贮运品质和货架期，不同树种和品种的果实都需要一定程度的软化，然而过度软化则会造成采收后腐烂甚至失去商品性[3]。果实在软化过程中，细胞壁组分和结构发生了复杂的变化[4]。肉质果实初生壁主要由35%的果胶、25%的纤维素、20%的半纤维素和10%的结构蛋白组成[5]。从结构上看，纤维素微纤丝构成了细胞壁的刚性骨架，果胶、半纤维素和糖蛋白组成的矩阵多糖嵌入在骨架中，各组分间相互联系，使细胞壁成为一个非常复杂的动态复合体。果实在成熟软化过程中各组分降解，复合体结构发生改变，细胞间隙变大。细胞壁内部结构的破坏是导致果实软化的直接原因[6]。

1.1 纤维素和半纤维素

纤维素是植物细胞壁的主要成分，它通过纤维素合酶复合体在细胞质膜上形成，大约2000个纤维素分子可通过链间氢键组成一个微纤丝，再通过木糖-纤维素微纤维构成细胞壁的网络骨架[7]。半纤维素也是初生壁的主要成分，是由木糖、阿拉伯糖和半乳糖等不同类型单糖以共价键、氢键、醚键和酯键连接构成的异质多聚体，各种单糖又形成不同的主链和侧链。有研究认为纤维素与果实成熟软化有关，但并非关键因子，而半纤维素结构变化与果实软化密切相关，是果实质地变化的重要因子[8]。张群等[9]研究发现葡萄在采后贮藏过程中的自溶软化与细胞壁代谢密切相关，纤维素和半纤维素含量显著降低，内果皮的超微结构被破坏。

1.2 果胶

果胶是植物细胞壁的重要组成部分之一，是细胞壁网络骨架之间的交联物，发挥着细胞缓冲的功能。果实成熟软化过程中，果实中的果胶物质由难溶的原果胶降解为可溶性果胶，其形态、组分发生了明显变化，细胞间的黏着力下降，果实质地变软。管雪强等[10]研究发现葡萄果实成熟软化时，果胶发生降解，可溶性果胶含量增多，而共价结合、离子型果胶含量减少。

2 果实成熟软化与细胞壁降解酶的关系

果实细胞壁是一个动态的网络结构，果实在成熟软化过程中，细胞壁水解酶单独或与蛋白质协同作用，引发中性糖损失，木葡聚糖解聚，细胞壁松弛[4]。参与细胞壁降解的酶主要包括果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，研究表明至少有30余种酶参与果实的成熟软化过程。

2.1 果胶甲酯酶

果胶甲酯酶（PME）是植物中广泛存在的第八类碳水化合物酯酶家族，参与众多的生理生化活动。果胶甲酯酶可去除果胶半乳糖醛酸残基C-6 酯化基团，从而生产带负电荷的果胶酸。带负电的果胶酸又以2 种形式调控细胞壁代谢：第一种形式，细胞壁中富含Ca2+，果胶酸与Ca2+相互作用，形成果胶钙，从而改变细胞壁的结构和理化性质，抑制其他果胶酶对其进行水解作用；第二种形式，果胶酸不与Ca2+作用，而直接成为PG、PL 酶的作用底物，果胶降解，细胞壁结构改变，果实软化[11]。近年来，有关葡萄果实软化与果胶甲酯酶活性及基因表达关系已有报道。Balic 等研究发现脆肉型葡萄品种“NN107”在果实发育P1（转色期）、P2、P3 时期PME 活性一直处于较高水平，P4（成熟期）迅速降低，软肉型品种“汤姆逊无核”在P1-P3 时期PME 活性逐渐升高，在P4 降低，且脆肉“NN107”中PME 活性一直高于“汤姆逊无核”中的活性，并结合2个品种细胞壁中钙含量，推测脆肉品种中较高的PME 活性有利于增加钙桥的形成，提高果实硬度[12]。Deytieuxbelleau 等[13]发现在“赤霞珠”葡萄果实生长发育过程中PME 酶活性与PME 基因表达不同步，PME 随着果实成熟表达量增加，得出PME 基因可能通过去甲酯化增加了其他细胞壁降解酶接触底物的机会，促进果实成熟。

2.2 多聚半乳糖醛酸酶

多聚半乳糖醛酸酶（PG）是第一个在番茄中利用转基因方法检测的水解酶，也是较早被发现在果实软化过程中对细胞壁降解起作用的水解酶[14]。它可以催化断裂未酯化的果胶主链上α-1，4 糖苷键，促使果胶降解，果实软化。植物PGs 是一个基因家族，根据作用方式不同，可分为内切PG（endo-PG）和外切PG（exo-PG）。内切PG 对底物的特异性较强，主要表现为随机裂解，而外切PG 对底物的特异性较弱，表现为依次水解聚糖链的非还原末端。有关PG 酶如何调节葡萄果实的成熟软化过程，研究发现软肉葡萄“汤姆逊无核”果实中PG 酶活性随着果实成熟逐渐升高，而脆肉果实PG 酶活性呈现相反趋势，得出PG 活性不同是造成葡萄果实质地差异的重要原因，只是在果实的软化过程中起到一定作用，但PG 基因诱导果实软化的机理还不是很清楚，有待于进一步研究[13]。

2.3 果胶裂解酶

果胶裂解酶（PL）是通过β-反式消除作用切割α-1，4 糖苷键，降解去甲酯化的果胶产生寡聚糖，参与果实成熟软化过程[15]。Nunan 等[16]发现葡萄果实中编码PL 酶基因在果实成熟时显著高表达，参与果胶多糖溶解，促进果实软化，认为PL 基因可能是调节果实成熟软化的一类重要的候选基因。

2.4 β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-Gal）是一类糖苷水解酶，在植物中广泛存在。主要作用于具有半乳糖残基支链的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ，切除β-D-半乳糖残基，从而使细胞壁多糖降解或溶解，果实软化[5]。近年来，研究者已在很多作物上发现了β-Gal 的同源基因，并对这些同源基因的表达模式进行分析，β-Gal 表达模式大致分为四种：第一种，表达量逐渐升高，果实成熟时达到最高水平；第二种，表达量在发育前期较高，开始成熟后表达量下降；第三种，表达量在果实整个生长发育过程中一直处于较高水平；第四种，表达量一直处于非常低的水平。目前普遍研究认为第一种表达模式的基因与果实成熟软化关系密切[17]。有关β-Gal 酶在葡萄果实成熟软化作用，研究者得出β-Gal 活性随着果实的成熟软化而增强，活性与葡萄果实硬度负相关，并对果实硬度起到了非常重要的作用[18]。

2.5 果实成熟软化与扩展蛋白与转录因子的关系

植物细胞壁中发现了一种没有水解酶或转糖基酶活性的细胞壁定位蛋白，扩展蛋白（EXP）。前人在压力松弛试验中发现，扩展蛋白可导致细胞壁松弛[19]。也有研究发现扩展蛋白可以破坏纤维素-半纤维素界面上非共价键，解锁网络，使细胞壁松弛[20]。Ishimaru 等[21]从“巨峰”葡萄果实中分离出Vlexp1-3 三种扩展蛋白，发现Vlexp3 在果实中特异性表达，且转色期表达量明显增加，并推测Vlexp1-3 基因可以与VXET1 协同作用，裂解细胞壁的纤维素-木葡聚糖网络，使“巨峰”葡萄果实在转色期变软。

近年来，有关转录因子调控果实成熟软化的研究也日益增多，研究表明LBD[22]，NAC[23]，MADS-box[24]，ERF[25]，bHLH[26]等 转 录 因 子 都 参与了果实的成熟软化过程。

3 转录组测序技术在葡萄果实成熟软化研究中的应用

RNA-seq 又称全转录组鸟枪法测序，是以高通量测序技术为基础的，可以便利地从整体水平上获得基因表达情况的测序方法。RNA-seq已经成为生命科学中研究基因表达水平最常用的方法，现几乎应用于植物科学的各个领域[27]。Wong 等[28]以果实硬度存在差异的“梅鹿辄”果实为试材，通过转录组分析发现17 个与细胞壁降解相关的基因在大果型“梅鹿辄”中较在小果型中显著高表达，推测这可能是造成大果型葡萄的软化速率高于小果型的主要因素。Balic 等[12]对“汤姆逊无核”葡萄不同发育时期果实进行转录组测序，发现随着果实的成熟与软化，细胞壁降解相关的基因表达水平显著提高，认为果实硬度降低可能与这些基因的高表达有关。Wei 等[29]对“夏黑”及其早熟芽变“天工墨玉”5 个不同发育时期果实进行转录组测序，筛选到多个可能加速果实成熟软化的关键基因。

4 QTL 定位在葡萄果实成熟软化及质地研究中的应用

葡萄果实成熟软化后的质地是影响果实品质的关键因素，近年来有关葡萄果实质地的QTL 定位已有一些报道，但相对其他性状而言，研究进展较慢。Carreno 等[30]分别以2 个分离群体构建图谱，首次定位到与果实硬度相关7 个QTL 位点，分别位于第1，4，5，9，10，13 和18 号连锁群上，这些位点中，最高可解释19∙8%的表型变异，所有QTL 位点共解释44∙5%的表型变异。Correa 等[31]以“红宝石无核”和“无核白”杂交的137 株后代构建遗传图谱，鉴定到2 个与果实硬度相关的QTL 位点，分别位于第8 和第18号连锁群上，2 个QTL 位点共同解释表型变异的27∙6%，置信区间为10 cM，其中位于LG8 的QTL位 于 标 记UDV125 和VMCNG2H2∙2 之 间，解 释表型变异的15∙6%，LG18 上的QTL 位于VVIN16标记和VVCSIE103N17FMI 标记之间，可解释表型变异的15∙6%。Ban 等[32]在第3 和第10 连锁群上发现了2 个与果实硬度相关的QTL 位点，3号连锁群的QTL 位于VMC2E7 标记附近，解释表型变异的15∙7%，10 号连锁群上的QTL 位于标记VVIH01 和标记UDV073 的中间区域，解释表型变异的14∙4%，经连续四年鉴定发现3 号连锁群上的QTL 位点比10 号连锁群上的位点更加稳定。Jiang 等[33]利用区间作图法在18 号连锁群上鉴定到了3 个与果实硬度相关的QTL 位点，命名为qBF18-2016，qBF18-2017 和qBF18-2018， 分别解释了22∙3%、21∙5%和28∙6%的表型变异。

5 总结

葡萄果实软化程度是衡量其鲜食品质的一个重要指标，同时也是重要的育种指标，然而果实软化及不同质地形成是个非常复杂的生理生化过程，与细胞壁组分及细胞壁降解酶活性密切相关，是由多基因控制的数量性状，不仅受基因型和遗传因素影响，也与环境因素密切相关。在今后研究中，要针对不同软化类型果实进行软化机制研究，应从组学入手，筛选与果实成熟软化及果实质地形成相关的基因及代谢通路，发掘相关的候选基因，开发分子标记，为今后葡萄品质育种和贮藏保鲜技术研究提供理论参考。