肠嗜铬细胞驱动内脏疼痛和焦虑机制

胃肠道表面覆盖一层薄上皮细胞，其中包含少量的多功能的肠内分泌细胞，它们通过释放激素和神经递质来调节诸如营养物质吸收、消化、蠕动、摄食行为和感知觉等功能。肠嗜铬 (enterochromaffin,EC) 细胞是一类独特的肠内分泌细胞亚型，可以检测引起或加剧疼痛的环境和内源性刺激，包括饮食刺激物、微生物代谢产物、炎症介质、机械扩张以及应激相关的激素和神经递质等。EC 细胞一旦被激活，就会释放5-羟色胺(5-HT)并作用于邻近表达5-HT3受体的感觉神经末梢上，将伤害性刺激信号传递到脊髓。肠道受到不同类型的脊髓传入神经的支配，包括对拉伸不敏感的黏膜神经和支配肌肉、血管或肠系膜并在一定阈值范围内对扩张有反应的神经。目前，EC 细胞及其邻近的黏膜传入神经在多大程度上参与急性或慢性内脏疼痛及其性别差异仍不清楚。该研究通过沉默或激活小鼠的EC 细胞对这些问题进行探究，并评估其对结肠感觉神经活动、内脏敏感性及行为的影响。

源于细菌的短链脂肪酸可以激活肠内分泌细胞，其中异戊酸 (isovalerate, ISV) 在内脏高敏人群中的水平升高，提示其可能参与痛觉过敏。研究表明，在体外神经-肠道标本模型中异戊酸通过G 蛋白偶联受体Olfr558 来激活EC 细胞，以5-HT 依赖的方式引起初级传入神经纤维的机械痛觉敏化。鉴于EC 细胞和感觉神经都具有机械敏感性，为了验证异戊酸是否使神经纤维对其他非机械刺激变得敏感，该研究首先使用光遗传学方法激活Nav1.8+感觉神经元（其在支配结肠的脊髓传入神经中占95%以上）。在Nav1.8-ChR2 雄性小鼠的离体神经-肠组织标本上施加异戊酸，能够增强黏膜传入神经对光刺激的敏感性。然而，雌性小鼠神经纤维的基线反应较雄性小鼠明显更高（即使在最低光刺激强度下也是如此），且不能被异戊酸处理进一步增强。因此，异戊酸介导的致敏作用并非特异性针对EC细胞或感觉神经元的机械刺激，而是增强此环路的兴奋性（以性别二态性的方式）。

Nav1.8-GCaMP6s 小鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)活体钙成像显示，雌性小鼠腰骶段DRG 神经元的基线活性较雄性小鼠更强，表明支配内脏靶器官（包括结肠）的神经元活性更强。雄性小鼠结肠内注射异戊酸能够激活6.5%的神经元，而雌性小鼠对异戊酸敏感的神经元要少得多(2.2%)。在雄性小鼠中，5-HT3受体选择性拮抗剂阿洛司琼 (alosetron) 可以抑制异戊酸诱导的反应，这一现象与异戊酸激活EC 细胞释放5-HT 并随后激活附近感觉神经末梢上的5-HT3受体这一机制相吻合。然而，阿洛司琼并没有改变雌性小鼠对异戊酸敏感的神经元的比例。为了确定异戊酸能否增强疼痛相关行为，检测了小鼠结肠内注射异戊酸后结直肠扩张 (colorectal distension, CRD) 的反射运动。结果表明，在一定扩张压力范围内异戊酸增强了雄性小鼠内脏运动反射 (visceromotor response, VMR)，而这一行为效应在雌性小鼠中严重削弱。

为探究异戊酸的致敏作用是否由EC 细胞特异性介导，该研究利用了破伤风毒素 (tetanus toxin from Clostridium tetani, TeNT) 抑制兴奋性细胞的突触囊泡融合和神经递质释放的能力。通过交叉遗传学手段获得了Pet1Flp;Tac1Cre系小鼠 (ECPFTox)，以实现在EC 细胞中特异性表达TeNT。为了验证表达TeNT 的功能，使用异硫氰酸烯丙酯 (allyl-isothiocyanate, AITC) 激活EC 细胞表达的TRPA1 通道并刺激5-HT 释放。与Tac1Cre对照组相比，AITC 引起ECPFTox组小鼠肠道类器官的5-HT 释放大幅减少（约为30%）。ECPFTox小鼠血清的5-HT 水平也有降低，提示EC 细胞是外周5-HT 的主要来源之一。

在Tac1Cre对照组小鼠的离体肠道-神经标本中，异戊酸增强了黏膜感觉神经对机械刺激的反应，尤其是在雄性小鼠中。然而，在ECPFTox雄性或雌性小鼠的离体肠道神经标本均未观察到这种敏化作用，从而证明异戊酸的致敏作用是通过EC细胞介导的。雌性ECPFTox小鼠基线VWR 反应与对照组相比降低。与体外实验结果一致，在ECPFTox小鼠中，结肠内施加异戊酸对扩张压力引起的雄性小鼠VMR 的敏化作用消失了。结果证实EC 细胞在内脏伤害性感受中发挥主要作用。此外，沉默EC 细胞对雌性小鼠有更大的影响，而雄性小鼠则表现出更强的异戊酸的致敏作用。结果提示，与雄性小鼠相比，EC 细胞-伤害性感受器环路在雌性中处于紧张性操控状态从而具有较窄的动力学范围。

该研究采用化学遗传学方法探究EC 细胞的激活是否足以引起内脏高敏。在EC 细胞上表达激活性DREADD 受体 (hM3Dq)，使其能够被去氯氮平 (deschloroclozapine, DCZ) 或氯氮平N-氧化物(clozapine-N-oxide, CNO) 选择性激活。将DREADD激动剂应用于源自EChM3Dq小鼠的肠道类器官可导致EC 细胞的激活和5-HT 的释放。此外，在DCZ处理15 分钟后，EChM3Dq雌性小鼠（而不是雄性）的血清中5-HT 含量增加，并在30 分钟后逐渐下降。DREADD 激动剂可以使EChM3Dq小鼠的神经纤维对黏膜机械刺激的敏感性增强，而对Tac1Cre对照组小鼠无显著影响，且这种致敏作用在雄性小鼠中更明显。为了检测内脏过敏反应，在结直肠扩张实验前15 分钟给EChM3Dq小鼠注射DREADD 激动剂，结果表明雄性小鼠在一定范围结肠压力下VMR 显著增加，而雌性小鼠的VMR 没有显著变化。给予阿洛司琼阻断了DCZ 介导的雄性小鼠VMR 的增强，这与在体实验结果一致。总的来说，这些性别差异与如下观念相一致，即EC 细胞-黏膜传入神经环路对雌性的结肠敏感性有更高的紧张性贡献而对于增强反应的窗口更窄。为了验证持续的EC 细胞激活能否产生类似于在IBS 中观察到的持续敏化，持续3 周每日给小鼠注射DCZ，并在停止给予DCZ 后72 小时评估结肠扩张引起的VMR 反应。结果显示，相较于Tac1Cre对照组小鼠，EChM3Dq小鼠在药物洗脱后仍然保持高敏感性，表明EC 细胞的激活足以驱动急性和持续性内脏疼痛。

初级传入神经纤维终止于肠道的不同分层，包括黏膜、肌肉和血管腔室以及肠系膜。一般认为，内脏疼痛是由对扩张敏感的低阈值和高阈值神经纤维所驱动，而非对扩张不敏感的黏膜传入神经。鉴于EC 细胞介导内脏疼痛的必要性，为确定除了黏膜传入神经外，是否还有其他神经受EC 细胞激活的影响，该研究使用了一种改良的离体神经-肠道标本模型，在这个模型中对完整的结肠环进行加压，可以激活对扩张敏感的传入神经（包括低阈值、高阈值和广动力域神经纤维），这些传入神经负责检测其感受区域内的环向张力。支配黏膜层的传入神经不会在这种范式下产生反应，从而能够将它们与其他传入神经区分开来。记录实验是在选择性表达TeNT 或DREADD 受体的小鼠EC 细胞中进行的。在对照组小鼠中，异戊酸不能增强支配非黏膜层的扩张敏感传入神经的活性。ECPFTox雌性或雄性小鼠的离体神经-肠道组织对结直肠扩张的VMR 降低，在给予异戊酸之前或之后表现出正常的扩张敏感神经激活。对于EChM3Dq雌性和雄性小鼠的离体神经-肠道组织，CNO 处理对扩张敏感的神经纤维没有显著影响。结果表明，内脏疼痛的调节是由对扩张不敏感的黏膜传入神经驱动的，这些纤维对局部组织变敏感，并直接与黏膜层中的EC 细胞相互作用。

功能性胃肠疾病通常与焦虑的增加有关。焦虑是影响肠-脑信号的双向传递的复杂疼痛或感觉信息处理障碍的重要表征之一。因此，接下来通过高架十字迷宫进一步探究慢性激活或者抑制EC 细胞是否会影响焦虑样行为。结果显示，经过DCZ 处理的EChM3Dq小鼠在开放臂中停留时间较短，表明小鼠的焦虑样行为增加。给予5-HT3受体拮抗剂阿洛司琼逆转DCZ 导致的焦虑样行为增加。结果表明5-HT 能EC 细胞-黏膜传入神经信号在调节肠-脑通讯紊乱的伤害性感觉成分和情感成分发挥重要作用。此外，ECPFTox小鼠在开放臂中停留时间也较短，表明长期抑制EC 细胞活性，扰乱胃肠道功能，同样具有致焦虑作用。

综上所述，该研究阐明了肠内分泌细胞与黏膜传入神经之间的相互作用，以及这种相互作用如何影响内脏疼痛和焦虑。结果表明，EC 细胞和黏膜传入神经是与IBS、炎性胃肠道疾病或其他炎症相关的内脏疼痛和焦虑的关键诱发因素，凸显了肠-脑轴在神经胃肠病学中的重要性。此外，功能性胃肠疾病在女性中的发病率更高，该研究表明EC 细胞-黏膜传入神经在雌性小鼠的紧张性输入更强。异戊酸或者急性化学遗传学激活EC 细胞不能进一步增加雌性小鼠的内脏敏感性。因此，EC 细胞-黏膜传入神经增强的活性可能使得雌性内脏疼痛的发病率更高。在EC 细胞鉴定性别特异性的分子和功能，可能会提供内脏疼痛性别差异机制的新见解。此外，鉴于功能性胃肠疾病与增加的焦虑有关，选择性5-HT再摄取抑制剂的治疗可能通过其外周和中枢靶点对病人有双重益处。