固相萃取-高效液相色谱-质谱联用法测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯残留

陆兰菲,赵学平,马 正,方 楠,骆玉琴,王晓梅,叶 会,雷 圆,王 强,*,张昌朋,*

(1.中国计量大学 生命科学学院,浙江 杭州 310018; 2.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所,浙江 杭州 310021)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为我国中医药记载的名贵药食两用药材,素有“神仙草”之称[1]。铁皮石斛中富含多糖、多酚、氨基酸、黄酮等活性物质[2],具有预防及治疗癌症[3],改善肝脏氧化应激、炎症和肝脂质积累等作用[4]。最新研究表明,铁皮石斛对慢性免疫性疾病具有潜在的治疗作用[5],还可增强自身免疫及抗氧化等多种功能[6]。2008—2014年铁皮石斛鲜茎产量由1 200 t增至14 800 t,呈现逐年增加的态势[7]。因其生长条件不喜阳不耐干燥,铁皮石斛黑斑病、蛞蝓等病虫害发生较严重。经查询,目前在铁皮石斛上登记的农药产品仅23个(杀虫剂8个);在铁皮石斛生产过程中,存在着超范围使用农药的情况。Zhang等[8]研究了24种农药在铁皮石斛中残留,83.33%的样品检出农药残留,农药残留是影响铁皮石斛质量安全的重要因素。

芸苔素内酯(图1-A)是一类具有显著促进作物生长的新型植物激素,被认为是具有多效作用的植物生长调节剂[9-10]。芸苔素内酯可有效诱导番茄果实成熟,增加番茄中可溶性糖、番茄红素含量、抗坏血酸、呼吸速率和乙烯生成,这说明芸苔素内酯在调节果实成熟的同时也参与了番茄果实品质性状的形成[11];通过叶面喷施芸苔素内酯固醇类似物(Biobras-16)对菠萝果实生长具有积极的作用[12]。这类化合物不含离子基团故很难离子化;不含共轭结构以及光电响应基团导致常规紫外检测器、荧光检测器无法检测其含量;沸点高,不易气化。目前检测方法有高效液相紫外检测技术[13]、高效液相色谱荧光检测器检测技术,因其结构的特性,这些方法繁杂且需衍生化。芸苔素内酯种类众多,2, 4-表芸苔素内酯(图1-B)因生物活性和人工合成效率高等优势被广泛应用在各种农作物中。2, 4-表芸苔素内酯相关农药残留研究少及进展不足,但在前期调查表明,尽管尚未登记,但铁皮石斛生产中已使用2, 4-表芸苔素内酯。因此进一步研究2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛中残留,为其在铁皮石斛上合理使用和提升铁皮石斛质量安全提供数据支撑。

图1 芸苔素内酯(A)和2,4-表芸苔素内酯(B)的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of brassinolide (A) and 2, 4-epibrassinolide (B)

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

2, 4-表芸苔素内酯原药[13-14](纯度93%,CAS:78821-43-9)购自浙江世佳科技股份有限公司;2, 4-表芸苔素内酯标准品(纯度≥98%)购自合肥博美生物科技有限责任公司;甲醇、乙腈 (HPLC级,Merck公司);甲酸 (HPLC级,美国ACS公司);甲酸铵(HPLC级,德国Honeywell公司);丙酮、正己烷(AR级)购自国药集团化学试剂有限公司;试验用水为屈臣氏瓶装矿泉水;萃取盐包(含1.5 g NaCl和6 g MgSO4,分析纯)购自杭州易镁创科技有限公司;Cleanert Pesti carb/NH2固相萃取小柱(500 mg,6 mL)购自上海安普实验科技股份有限公司;陶瓷均质子购自合肥博美生物科技有限责任公司;0.22 μm一次性针式过滤器有机尼龙针头滤膜购自天津博纳艾尔杰科技有限公司。

1.2 仪器设备

G 6470型高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国Agilent公司);SK-7200 H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);NMSG-12型涡旋振荡器(泰州米诺医疗科技有限公司);6430 R型高速冷冻离心机(Pendorf 公司);BSA2202S型万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.3 样品制备

选2年生铁皮石斛组培苗为供试材料,种植于浙江省农业科学院试验基地大棚内。在大棚中炼苗一个月后进行喷雾处理[15]。喷雾时添加助剂:1%乙醇与3%吐温80[16]。试验共设3组:T1组,2, 4-表芸苔素内酯浓度为0.02 mg·L-1;T2组,2, 4-表芸苔素内酯浓度为0.05 mg·L-1;T3组,对照组。采用叶面喷施方式共施药两次,施药间隔为30 d,在第二次施药后采集0、1、7、14、28和35 d的铁皮石斛样品(茎、叶),留样500 g,保存在-20 ℃冰箱待测。

1.4 样品前处理

提取:分别精准称取10.00 g(精准至0.01 g)铁皮石斛叶和茎样品于50 mL离心管中,加入5 mL水充分浸润样品后再加入15 mL乙腈,超声提取15 min,然后加入1.50 g NaCl和6.00 g MgSO4,在每个离心管中放置一只陶瓷均质子,涡旋振荡2 min后以8 000 r·min-1离心10 min,将上清液转移至圆底烧瓶,在40 ℃水浴下旋蒸近干,然后用2 mL丙酮∶正己烷=6∶4(体积比)的混合液复溶,待净化。

净化:Cleanert Pesti carb/NH2小柱用10 mL混合液活化,将2 mL上述复溶液上样,再用25 mL混合液淋洗小柱,收集所有滤液,40 ℃水浴旋蒸近干,再用2 mL乙腈复溶,超声1 min,过0.22 μm有机滤膜,待上机测定。

1.5 仪器条件

液相色谱条件:色谱柱为Waters C18柱 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流动相为甲醇(A)、含0.1%甲酸和2 mmol·L-1的甲酸铵水溶液(B),柱温40 ℃,流速为0.4 mL·min-1,进样体积20 μL。梯度洗脱为:0～0.5 min,10% A;0.5～2.5 min,10%～92% A;2.5～4 min 92% A;4～4.01 min,92%～10% A;5.5 min,10% A。

质谱条件:采用ESI+模式,MRM多反应监测,干燥器温度300 ℃,干燥器流量为5 L·min-1,雾化器压力为45 psi,鞘气温度为350 ℃,鞘气流量为11 L·min-1,毛细管电压为4 000 V。2, 4-表芸苔素内酯的监测离子对及相关参数见表1。

表1 2,4-表芸苔素内酯的质谱条件Table 1 The mass spectrometric parameters of 2, 4-epibrassinolide

1.6 基质标准溶液的配制及基质标准曲线绘制

准确称取2, 4-表芸苔素内酯标准品0.011 1 g于100 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成100 mg·L-1的标准储备液,4 ℃下保存。用空白基质 (茎、叶)提取液逐级稀释成0.000 5、0.002 5、0.025、0.05、0.1、0.25 mg·L-1的标准曲线溶液,现配现用。按1.5节中仪器条件测定,重复3次,以2, 4-表芸苔素内酯的质量浓度为横坐标(x),对应浓度的峰面积为纵坐标(y),绘制标准曲线,采用外标定量法。通过预实验发现有明显的基质效应,故选择基质标准曲线进行浓度的计算[17]。

1.7 添加回收试验

在空白铁皮石斛茎和叶中分别添加0.005、0.05、0.5 mg·kg-1的2, 4-表芸苔素内酯,同时设置空白对照,每个处理重复3次,混匀后静置30 min,样品前处理及仪器测定分别按1.4节与1.5节进行,并计算平均回收率(average recovery,%)以及相对标准偏差(relative standard deviation,RSD,%)。

1.8 统计分析

基质效应[18]由公式(1)计算所得:

(1)

其中VME为基质效应,A为绘制溶剂标准曲线所得斜率,B为绘制基质标准曲线所得斜率。 当VME值为正时,基质呈增强作用;VME值为负时为抑制作用,绝对值越大则相应作用愈明显。

农药降解动态方程和半衰期[19](T1/2)由公式(2)和公式(3)计算所得:

Ct=C0e-kt;

(2)

(3)

其中Ct为t时刻农药浓度(mg·kg-1),C0为农药初始浓度即原始沉积量(mg·kg-1),k为2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛中降解速率常数。

采用Excel 2019和SPSS 26进行残留数据分析,Graph Pad Prism 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

比较了同等梯度下甲醇和乙腈作为有机溶剂时,2, 4-表芸苔素内酯的峰型以及峰面积,结果发现甲醇作为溶剂时灵敏度更高且峰型更好,水相中加入2 mmol·L-1甲酸铵能使2, 4-表芸苔素内酯更容易离子化,响应值更佳。对比色谱柱T3与C18的响应值发现C18柱无论是响应值还是峰形均比T3色谱柱好。所以最终选取甲醇-0.1%甲酸水(内含2 mmol·L-1甲酸铵)和C18为最佳流动相和色谱柱。

2.2 质谱条件的优化

选用正离子ESI+模式对2, 4-表芸苔素内酯的标准溶液进样,先进行质谱全扫描从而确定母离子,通过离子扫描以优化锥孔电压,最后在子离子扫描模式通过优化碰撞电压。优化后的2, 4-表芸苔素内酯的质谱条件及离子色谱图见表1和图2。

图2 2,4-表芸苔素内酯(0.1 mg·L-1)基质标准溶液定量离子色谱图Fig.2 Quantitative ion chromatogram of 2, 4-epibrassinolide (0.1 mg·L-1) matrix standard solution

2.3 前处理的优化

2.3.1 提取方式的选择

对比超声、涡旋、超声与涡旋联用3种方式进行提取条件优化,以回收率为指标,3种提取方式回收率结果:81.67%、67.63%、90.50%,如图3-A。超声有助于提高2, 4-表芸苔素内酯在乙腈中的溶解,涡旋有效提取目标化合物,二者联用提升2, 4-表芸苔素内酯提取率。

图3 不同条件对回收率的影响Fig.3 The effect of different conditions on the recovery rate

2.3.2 提取溶剂选择

实验选择乙腈[20-21]、丙酮、甲醇这3种提取溶剂进行对比优化,以提取效率为指标对3种不同试剂进行对比,提取率分别为84.98%、95.18%、77.46%,如图3-B所示。丙酮能将样品中的脂类、大量色素等物质提取出来,经SPE小柱净化后提取液颜色呈黄绿色,且色谱图基线杂质干扰较大。鲜样水分较干样多,用乙腈提取后盐析效果比丙酮佳,且色谱图基线稳杂质干扰较小,因此选择乙腈作为提取溶剂。为了让样品充分浸润,提高提取率,添加乙腈前加入5 mL水。

2.3.3 提取溶剂体积的优化

比较了10 mL、15 mL、20 mL乙腈对2, 4-表芸苔素内酯回收率的影响,结果如图3-C所示。加入10 mL乙腈时,回收率小于70.00%;加入15 mL乙腈时,回收率为95.18%;加入20 mL乙腈时,回收率为88.10%。因此,提取溶剂乙腈的体积选取15 mL。

2.3.4 净化材料的选择

考察Oasis HLB (500 mg,6 mL)、Cleanert NH2(500 mg,6 mL)、Cleanert Pesti Carb/NH2(500 mg,6 mL)、 Cleanert PEP-2(500 mg,6 mL)、 Cleanert TPH (2 g,12 mL)和Cleanert NANO(1 mL)碳纳米净化萃取小柱等6种净化材料对2, 4-表芸苔素内酯回收率的影响,结果如图3-D所示。选用Cleanert Pesti Carb/NH2固相萃取小柱时,回收率达到91.52%,RSDs在5.1%～7.9%,且杂质净化效果佳。因此,选择Cleanert Pesti Carb/NH2对样品进行净化。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准工作方程、线性范围和基质效应

在0.000 5～0.25 mg·L-1范围内,2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛茎、叶中的线性方程分别为:y=421 887x+391.91和y=441 297x+5 053.1,两种基质条件下相关系数(R2)均大于0.99,峰面积和质量浓度之间线性关系良好。基质效应在-31%～-53%,有明显的基质抑制效应。定量限(LOQs)和检出限(LODs)分别为0.005 mg·kg-1和0.000 5 mg·L-1,该方法灵敏度高。

2.4.2 平均回收率及精密度

在铁皮石斛的茎、叶中分别添加2, 4-表芸苔素内酯标准溶液,进行3个水平上的添加回收试验,每一个添加水平重复6次,添加回收率以及RSD结果见表2所示。结果表明,2,4-表芸苔素内酯平均回收率在94.70%～102.25%,相对标准偏差(RSD)在1.3%～3.4%,方法的准确度及精密度均满足《农作物中农药残留试验准则》(NY/T 788—2018)的残留分析要求。

表2 铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的回收率和精密度Table 2 Average recovery and precision of 2, 4-epibrassinolide in Dendrobium officinale

2.5 实际样品中的应用

利用室内盆栽试验获得铁皮石斛样品。在40盆铁皮石斛上喷施2, 4-表芸苔素内酯(内含1%乙醇与3%吐温80)。根据不同剂量分别为T1组0.02 mg·L-1;T2组0.05 mg·L-1;进行叶面喷施两次,间隔一个月后,根据 0、1、7、14、28和35 d的铁皮石斛(茎、叶)样品进行采集,待测铁皮石斛样品置-20 ℃冰箱保存。2, 4-表芸苔素内酯将本文建立的方法应用于实际铁皮石斛样品中2, 4-表芸苔素内酯的测定。经HPLC-MS/MS测定数据与Excel数据分析得出2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛(茎、叶)中的残留动态(表3)符合一级动力学方程,结果见表3。2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛(茎、叶)中残留量随时间推迟而降低。如图4-A、B,T1组铁皮石斛叶中2, 4-表芸苔素内酯14 d的降解率为85.59%;茎中2, 4-表芸苔素内酯在14 d的降解率为75.06%。T2组铁皮石斛叶中2, 4-表芸苔素内酯在35 d的降解率为87.33%;茎中2, 4-表芸苔素内酯在35 d的降解率为71.34%。2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛茎中的半衰期为10.35～22.36 d,在叶中的半衰期为8.89～11.00 d。2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛茎中的消解半衰期(22.36 d)大于叶中的消解半衰期(11.00 d)[22]。结果表明,该方法的灵敏度、准确度、精密度均满足铁皮石斛实际样品中2, 4-表芸苔素内酯的分析要求。

表3 不同浓度2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛中的残留、线性方程、相关系数和半衰期Table 3 Residues, linear equations, correlation coefficients and half-lives of different concentrations of 2,4-epibrassinolide in Dendrobium officinale

图4 不同浓度2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛(茎和叶)中的残留动态Fig.4 Residue dynamics of 2, 4-epibrassinolide at different concentrations in Dendrobium officinale (stem and leaf)

3 结论

本文建立了基于固相萃取结合HPLC-MS/MS检测铁皮石斛茎、叶中2,4-表芸苔素内酯残留分析方法,其定量限和检出限分别为0.005 mg·kg-1和0.000 5 mg·L-1。在0.005、0.05和0.5 mg·kg-1添加水平下,2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛中的平均回收率在94.70%～102.25%,相对标准偏差在1.3%～3.4%。该方法操作简便、净化干净,且回收率、精密度、重现性等指标均满足农药残留检测要求。利用该方法检测了铁皮石斛实际样品,结果显示,T1组铁皮石斛叶中2,4-表芸苔素内酯14 d 的降解率(85.59%)大于茎(75.06%);T2组铁皮石斛茎、叶中2, 4-表芸苔素内酯35 d的降解率分别为71.34%和87.33%。和T1组(0.02 mg·L-1)相比,T2组(0.05 mg·L-1)2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛茎叶中的降解更慢。2, 4-表芸苔素内酯在铁皮石斛茎和叶中的半衰期分别为10.35～22.36 d和8.89～11.00 d。本研究为铁皮石斛中2, 4-表芸苔素内酯的残留检测提供了可靠的分析方法。