利用CRISPR/Cas9技术编辑OsRR22基因创制耐盐水稻种质资源

牛淑琳 鞠培娜 周冠华 戴南平 周晋军 谢先芝 郑崇珂

摘要：水稻是重要的粮食作物之一，在盐碱地开发和改良中发挥着重要作用。为了创制高耐盐水稻种质资源，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在水稻品种盐丰47中对OsRR22设计3个靶位点进行基因编辑。通过PCR和测序鉴定，在To代获得16个突变单株，其中靶位点1和靶位点2均有纯合突变，靶位点3没有检测到突变。在T1代转基因株系中，获得3株纯合突变且无T-DNA插入的纯合突变体。对T2代进行农艺性状分析发现，与野生型相比，突变体的株高显著降低，产量相关农艺性状均无显著变化。苗期耐盐性鉴定结果表明，在200 mmol/L NaCI处理7天后，突变株的存活率比野生型提高30%以上。综上，利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种盐丰47进行了耐盐性改良，为耐盐水稻新品种的培育提供了理论和材料基础。

关键词：水稻；耐盐性；OsRR22；基因编辑

中图分类号：S511：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0030-06

盐渍化一度被称为土地的“绝症”，目前中国的盐碱地面积约为1亿公顷，其中可改良利用的盐碱地约667万公顷，这是一笔“沉睡”的宝贵资源。水稻是世界上重要的粮食作物之一，也是中国种植面积最大的粮食作物，对于保障粮食安全至关重要。水稻是一种对盐浓度中度敏感的作物，由于其特殊的栽培方式，已成为盐碱地改良利用的先锋作物。为了更好地发挥水稻在盐碱地改良中的作用，提高水稻耐盐性，培育优质耐盐水稻品种已经成为提高盐碱地利用率和保障国家粮食安全的重要手段。

植物反应调控因子RR（response regulator）是一类重要的转录因子，参与细胞分裂素的信号转导，调控植物的生长发育和胁迫耐性。水稻中包括13个A型RR基因（OsRRl-OsRR13）和6个B型RR基因（OsRR21-OsRR26）。Os-RR22/ORR2编码一个含有696个氨基酸的B型反应调节蛋白，对于水稻的正常生长发育起着重要作用，该基因突变后水稻的耐盐性明显提高。WoIrhen等发现与野生型相比rr2//22/23突变体叶片更短，更窄：穗长变短，分支数变少：根长变短，侧根形成量减少：而且在rr2//22/23突变体中，花药心皮的柱头刷发育受到损害从而妨碍花粉捕获，这可能是导致籽粒填充不良的原因。Zhang等利用Cas9-OsRR22-gRNA表达载体敲除OsRR22，发现T2纯合突变株的耐盐性较野生型（wild type，WT）植株明显增强。玉米中ABPH基因编码A型应答调控因子ZmRR3，ABPHI通过负向调节细胞分裂素诱导的茎分生组织的扩张限制茎尖原基的起始空间，从而控制叶的分生模式。

CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的一种准确、方便、高效的基因组编辑方法。基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术作为连接功能基因和遗传改良的桥梁，越来越受到育种家的关注。Li等利用CRISPR/Cas9系统编辑Xa13启动子，获得了抗白叶枯病水稻。Zeng等利用CRISPR/Cas9系统同时编辑2个与产量相关的负调控基因（OsPIN5b和CS3）和1个耐冷基因（OsMyB30），获得了高产耐冷水稻新品种。Alfatih等利用CRISPR/Cas9技术获得的水稻PARAQUAT TOLERANCE3（Os PQT3）基因敲除突变体具有更高的产量及抗氧化和盐胁迫能力。

本研究利用CRISPR/Cas9技术，以黄河三角洲盐碱地主栽品种盐丰47为遗传转化受体材料，对耐盐基因Os RR22进行编辑，获得有育种价值的纯合突变体，为培育适宜在黄河三角洲鹽碱地种植的水稻品种提供耐盐材料。

1材料与方法

1.1试验材料与载体

以黄河三角洲盐碱地主栽品种盐丰47为遗传转化受体材料。所有材料种植于山东省农业科学院饮马泉试验基地，常规水肥管理。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体（pYLCRISPR/Cas9Pubi-H）由华南农业大学刘耀光课题组馈赠。

1.2靶位点设计与载体构建

在水稻基因组注释计划数据网站RAP（ht-tps：//rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html）下载Os-RR22（Os06901831CO）基因组序列，利用CRISPR-GE（http：//skLscau.edu.cn/）设计OsRR22敲除靶点，选择特异性好的候选靶位点作为目的靶位点，共选择3个靶位点。载体构建参考单子叶敲除载体构建方法进行，针对3个靶位点，设计gRTl、gRT2、gRT3引物对，用于构建gRNA中间载体。Hpt和Cas9引物对分别用于转基因植株筛选过程中对抗潮霉素基因Hpt和Cas9基因的筛选，OsRR22引物对用于对靶位点的重测序分析。引物（表1）合成与转基因靶位点测序由北京擎科生物科技有限公司（青岛）完成。构建好的转化载体送至武汉伯远生物科技有限公司进行遗传转化。

1.3To代转基因株系获得及突变位点检测

利用CTAB法提取获得的转基因To代植株的基因组DNA，利用潮霉素基因Hpt进行转基因植株的阳性检测。利用OsRR22F2和OsRR22R2引物进行靶位点扩增，扩增片段送北京擎科生物科技有限公司（青岛）进行测序。利用DNAMAN软件进行测序结果分析。

1.4T1代无T-DNA株系筛选

将T0代自交获得的T1代种子单株种植，分别提取DNA后用Hpt和Cas9基因检测引物（表1）进行检测，两对引物都不能扩增出目的条带，则认为该株系为无T-DNA插入株系，可用于下一步的分析。

1.5T2代纯合突变体农艺性状调查

T1代无T-DNA插入的单株自交后获得T2代无T-DNA插入株系。每个株系种植3行，每行10株，行距×株距为25 cmx14 cm。在水稻抽穗期进行转基因后代的抽穗期调查：待水稻完全成熟后，每个株系选择15个单株进行株高、有效分蘖数、主穗长、主穗实粒数、千粒重等农艺性状调查。

1.6OsRR22突变体耐盐性鉴定

将纯合的Os RR22突变体与野生型种植在96孔板上，以Yoshida营养液培养至三叶一心，参照张治振等的方法对突变体和对照进行盐处理，具体为：水稻幼苗长到三叶一心后，用含有200mmol/L NaCl的Yoshida营养液处理7天，然后用不含NaCl的Yoshida营养液恢复培养7天，统计突变体和野生型存活单株数（有一片绿叶存活即记为存活单株），统计存活率。

存活率（%）=存活单株数／处理单株数×100。

2结果与分析

2.10sRR22基因编辑靶位点设计与载体构建

为提高突变效率，在OsRR22基因内部设计3个敲除靶位点，其中，在第一外显子区设计两个靶位点T1和T2，分别距离起始密码子ATG 52 bp和117 bp，PAM序列均为CGG；T3靶位点位于第二外显子区，距离ATG 522 bp，PAM序列为TGG（图1A）。OsRR22-CRISPR敲除载体如图1B。

2.2T0代转基因株系的检测及突变情况分析

将构建好的载体利用农杆菌介导法进行转化，共获得16株转基因苗。用潮霉素（Hpt）引物进行检测，所有植株均能检测到特异条带，说明均为转基因阳性苗（图2）。

利用特异性引物OsRR22F2和OsRR22R2對转基因植株的靶位点区域进行扩增并测序分析。16个株系在靶位点Tl和12均发生突变，突变效率为100%，在T3靶位点未发生突变。其中，在靶位点T1检测到纯合突变株3株，占18.75%，杂合突变株5株，占31.25%，双等位突变株8株，占50.00％；在靶位点T2检测到纯合突变株4株，占25.00％，杂合突变株3株，占18.75％双等位突变株9株，占56.25%。

2.3T1代无T-DNA元件的突变植株筛选

将盐丰47背景的To代靶位点T1为纯合突变的单株自交后获得T1代种子。随机选取T1代种子100粒，萌发后种植在去除底部的96孔板中，以营养液培养至三叶一心期。按顺序取样后提取基因组DNA。用潮霉素鉴定引物进行筛选，获得无潮霉素扩增的单株。然后对靶位点进行测序验证，获得纯合突变且无T-DNA插入的单株，根据检测到的单株排序，命名为rr22JI，rr22K1、rr22L/等（图3）。自交留种后获得T2代纯合突变的转基因株系，进行农艺性状和耐盐性分析。

2.4T2代纯合突变体农艺性状分析

对各个转基因株系和野生型植株的调查结果表明，野生型植株和突变体植株抽穗期没有明显差异，突变体植株比野生型植株株高显著降低，有效分蘖数、穗长、穗粒数、千粒重均无明显差异（图4）。说明Os RR22基因的敲除能够显著降低水稻株高，但对产量性状影响不显著。

2.5T2代纯合突变体耐盐性分析

为了鉴定突变体的耐盐性，选择3个T2代纯合突变体（rr22J1、rr22K1和rr22L/）和野生型盐丰47，同时种植在96孔板上进行耐盐性试验，结果（图5）表明，野生型盐丰47盐处理后存活率只有28.81％，而突变体rr22J1、rr22K、rr22L1的存活率分别为70.71％、76.81％和58.89％，均显著高于野生型盐丰47，说明利用CRISPR/Cas9技术创制的基于OsRR22基因的突变体耐盐性显著提高。

3讨论与结论

CRISPR技术是近年来发展迅速的基因定点编辑技术，是继锌指核酸酶（zine finger nuclease，ZFN）技术和转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases．TALENs）之后的第三代基因标记技术，具有成本低、效率高、构建简单、操作便捷、特异性强等特点。利用该技术能够快速完成基因敲除、插入、替换、点突变、转录调控和表观修饰等操作，在细菌、植物和动物中均有应用，如Wu等利用CRISPR/Cas9技术成功将1，4-BDO（1，4-butanediol）合成途径插入E．coti中，实现了1，4-BDO在微生物中的代谢生产；Gao等采用CRISPP/Cas9技术将NRAMP1（natural resistance-associated macrophage protein-1）基因敲入奶牛中，获得了11头抗结核转基因牛；Tang等利用CRISPR/Cas9系统敲除金属转运体基因OsNramp5，培育出Cd积累量低且无转基因的新稻株。在水稻中已有多个基因编辑提高水稻耐逆性、抗病性的报道。本研究结果也表明，该技术能够有效地应用于水稻耐盐种质创新中。

本研究利用CRISPR/Cas9技术对粳稻品种盐丰47进行耐盐基因OsRR22的定点编辑，以期获得具有育种利用价值的纯合突变材料。结果发现在获得的16个To代转基因株系中单个靶位点纯合突变率最高为25％，以碱基插人为主（频率为80％）：没有发现两个靶位点同时变异的纯合株系：靶位点3没有出现变异，可能是靶位点设计不合理或该靶位点在盐丰47基因组中与参考基因组存在序列差异，导致打靶失败。选择靶位点1纯合突变的株系自交繁殖后获得T1代群体，靶位点测序显示是与To代靶位点突变一致的株系，说明CRISPR技术编辑产生的突变能够稳定遗传给下一代。通过潮霉素标记筛选，将无T-DNA插入且靶位点纯合突变的3个转基因株系进行农艺性状分析，结果发现除了株高有降低外，抽穗期和产量相关性状均没有明显差异。通过苗期盐处理后存活率统计发现，转基因后代的耐盐性显著提高（增幅超过30个百分点）。因此对OsRR22基因进行定点编辑，能在不影响水稻产量的同时显著提高水稻的耐盐性：同时CRISPR/Cas9技术为水稻抗逆种质的创新提供了有利工具。