血清ctDNA及miR-21、IL-17、vWF与弥漫大B细胞淋巴瘤患者R-CHOP疗效的关系研究

张 朦,许 晶,丁曼华,徐海亭,张 涛

徐州市肿瘤医院肿瘤放疗科,江苏徐州 221000

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)为临床中最为常见的非霍奇金淋巴瘤亚型,占非霍奇金淋巴瘤的30%～35%[1],近年发病的病例数有上升趋势。虽然此病具有进展迅速、高侵袭性等病理特征,但可被治愈,化学药物治疗是此病常用治疗方法,R-CHOP方案为DLBCL临床治疗的一线方案使患者临床缓解率显著提高,患者生存时间得到明显延长,但仍有部分患者应用R-CHOP后出现不理想疗效,如耐药、复发、进展等[2],故有必要从分子学角度探讨DLBCL患者R-CHOP疗效的相关因素,以改善患者预后。循环肿瘤DNA (ctDNA)指肿瘤细胞DNA通过凋亡或分泌后释放至机体循环血液中,为肿瘤生物标记中的重要角色,在恶性肿瘤疗效评估及复发预判中具有重要意义[3]。微小核糖核酸-21(miR-21)与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等恶性行为有关[4]。白细胞介素-17(IL-17)属IL-17A家族成员,由CD4+T细胞分泌,能够参与肿瘤病的发病过程[5]。血管性血友病因子(vWF)为一种多聚体糖蛋白,与血管生成、炎症、肿瘤扩散有关[6]。现国内外可见一些关于实体瘤患者ctDNA、miR-21、IL-17、vWF与其疗效预后关系的研究,但在DLBCL中的报道还相对较少。本研究拟研究血清ctDNA及miR-21、IL-17、vWF与DLBCL患者R-CHOP疗效的关系,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016 年4月至2022年4月在本院确诊并收治的109例DLBCL患者为研究对象。纳入标准:(1)根据2008年WHO淋巴瘤分类相关标准,通过淋巴结组织病理证实为DLBCL[7];(2)初治患者;(3)年龄20～80岁;(4)无其他肿瘤疾病;(5)无精神疾病;(6)生存期预计不少于90 d;(7)签署知情同意。排除标准:(1)患有严重的人体关键脏器功能障碍;(2)病历资料不完整;(3)凝血功能障碍;(4)生命终末期;(5)妊娠及哺乳期女性;(6)依从性差;(7)参与研究前行相关治疗;(8)近期有梅毒螺旋体、乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒感染史;(9)合并自身免疫性疾病。本研究经笔者所在医院的伦理委员会批准。

1.2方法 (1)临床评测资料收集:包括完整的病史、体格检查、影像检查、免疫组化、骨髓检查、血常规检查、国际预后指数(IPI)评分[8]、化疗期间感染状况等。(2)血清IL-17、vWF水平检测:治疗后12 h内采集所有患者的空腹静脉血3 mL,离心(4 000 r/min、15 min),取上清液,采用酶联免疫吸附试验法检测血清IL-17、vWF水平。(3)血清miR-21检测:采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测。miRNA提取分离试剂盒(北京艾克赛仑生物)提取血清内总RNA,Nano-400A超微量核酸分析仪(北京原平皓生物)测总RNA浓度与纯度,将提取的总RNA于-80 ℃条件下保存备用。miRNA cDNA第一链合成试剂盒(北京百泰克生物)将miRNA反转录成cDNA。实时荧光定量PCR仪(山东巴罗克生物)进行扩增,扩增程序:95 ℃、5 min预变性,94 ℃、20 s变性,72 ℃、34 s退火,60 ℃、34 s延伸,收集荧光,总共40个循环。U6为内参,以2-ΔΔCt计算miR-21相对表达量,ΔCt为CtmiR-21-CtU6。实验重复3次后取均值。(4)血清ctDNA测定:采用qPCR检测。量取750 μL血清,加入磷酸盐缓冲液,充分混匀后孵育10 min,然后以16 000×g离心10 min之后收集上清。将PCR反应液(DNA模板2.0 μL,Super green 1.0 μL,Master 10.0 μL,H2O 6.0 μL,正向、反向引物各0.5 μL)加至PCR扩增板之中,扩增结束后,测Ct值,以2-ΔΔCt计算ctDNA水平。(5)治疗方法:给予R-CHOP方案治疗。第0天利妥昔单抗375.0 mg/m2(上海罗氏制药有限公司,国药准字J20080054),第1天环磷酰胺750.0 mg/m2(通化茂祥制药有限公司,国药准字H22022673),第1天长春新碱1.4 mg/m2(2.0 mg/m2为最大剂量,深圳万乐药业有限公司,国药准字H44021772),第1天吡柔比星50.0 mg/m2(浙江海正药业股份有限公司,国药准字H20045982),第1～5天泼尼松60.0 mg/m2(天津市津津药业有限公司,国药准字H12020036)。疗程周期21 d,治疗3疗程。(6)疗效评价:根据Lugano修订版(2014年)淋巴瘤疗效评估标准[9]予以评价,疗效等级共4个即病情完全缓解、部分缓解、疾病稳定、病情进展,前两者归为有效组,后两者归为无效组。

2 结 果

2.1DLBCL患者治疗前后血清ctDNA及miR-21、IL-17、vWF水平比较 与治疗前比较,DLBCL患者治疗后血清ctDNA、miR-21、vWF水平明显降低,IL-17水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 DLBCL患者治疗前后血清ctDNA及miR-21、IL-17、vWF水平比较

2.2DLBCL患者R-CHOP疗效的单因素分析 所有DLBCL患者R-CHOP疗效有效率为83.49%(91/109)。两组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。与有效组比较,无效组Ann Arbor分期(Ⅰ～Ⅱ期/Ⅲ～ Ⅳ期)、IPI评分(0～2分/3～5分)、脾大(否/是)、贫血(否/是)、乳酸脱氢酶(LDH)≥220 IU/L(否/是)、球蛋白(GLB)>34 g/L(否/是)、化疗期间感染(否/是)比例及血清ctDNA、miR-21、vWF水平明显增高,IL-17水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 DLBCL患者R-CHOP疗效的单因素分析或n/n)

2.3多因素分析 将单因素中P<0.05的因素纳入Logistic回归多因素分析中,赋值变量为Ann Arbor分期(Ⅰ～Ⅱ期=0;Ⅲ～ Ⅳ期=1)、IPI评分(0～2分=0;3～5分=1)、脾大(否=0;是=1)、贫血(否=0;是=1)、LDH≥220 IU/L(否=0;是=1)、GLB>34 g/L(否=0;是=1)、化疗期间感染(否=0;是=1),多因素分析发现,IPI评分3～5分及血清ctDNA、miR-21、IL-17、vWF水平为DLBCL患者R-CHOP疗效的影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 Logistic回归多因素分析

2.4通过ROC曲线评估血清ctDNA、miR-21、IL-17、vWF对DLBCL患者R-CHOP疗效的预测价值 绘制ROC曲线发现,血清ctDNA、miR-21、IL-17、vWF联合预测DLBCL患者R-CHOP疗效的效能[曲线下面积(AUC)=0.821]要高于各指标单独应用(AUC=0.706、0.652、0.638、0.677),其预测灵敏度与特异度依次为66.72%、92.32%,截断值依次为102.9 ng/mL、1.59、8.51 pg/mL、9.61 μg/mL。见表4、图1。

图1 ROC曲线分析

表4 ROC曲线相关参数

3 讨 论

ctDNA是与恶性肿瘤关系极为密切的标志物,起源于肿瘤或者循环肿瘤细胞的DNA片段(单链或双链)[10]。丁巍等[11]研究报道,监测肝癌患者术后血ctDNA水平变化发现ctDNA含量越高者其生存期越短,这有助于医生预判患者术后预后状况。王书楠等[12]研究报道,Bcl-2/MYC双表达为DLBCL预后分子标志之一,DLBCL患者中伴Bcl-2/MYC双表达者的肿瘤侵袭性相对较强,R-CHOP治疗后多预后不佳,而ctDNA阳性患者Bcl-2/MYC双表达占比大幅度高于ctDNA阴性患者(P=0.038)。本研究结果提示,DLBCL患者经R-CHOP治疗后的血清ctDNA水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),由此说明ctDNA水平随药物治疗会发生变化。在R-CHOP治疗获益患者中ctDNA水平下减低,而在疾病进展患者中ctDNA水平呈现出升高趋势,提示血浆ctDNA水平可能与肿瘤负荷存在一定相关性。原因可能为R-CHOP治疗疗效有效时,肿瘤负荷整体减小,释放至血液中的肿瘤细胞数减少,ctDNA水平也随之下调[13]。

miRNA为一类非编码分子,能够调节细胞分化、凋亡、增殖、分裂等,并参与肿瘤发生及发展过程。miR-21为miRNA中的一种,其参与乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞侵袭和迁移已有多项研究报道[14-15]。以往研究报道,Ⅲ/Ⅳ期DLBCL患者miR-21表达量较Ⅰ/Ⅱ期患者明显增高,DLBCL患者miR-21表达量增加有可能提示肿瘤恶性程度高及患者不良预后[16]。本研究于治疗前后检测miR-21在DLBCL患者中的水平发现,其与R-CHOP疗效关系密切,为R-CHOP疗效的影响因素之一。牟永平等[17]研究报道,PTEN蛋白为miR-21分子的靶基因之一,miR-21分子通过PTEN蛋白可激活细胞内PI3K/AKT途径,而该途径具有促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡的作用,和化疗耐药密切相关。这或许可以解释miR-21与DLBCL患者R-CHOP疗效之间的关系。

vWF为一种多聚体糖蛋白,该蛋白除与人体内止血、血栓形成相关外,还与肿瘤性疾病有关。有研究报道,vWF能介导胃恶性肿瘤细胞聚集,并与血小板、内皮细胞间互相作用,发挥促进肿瘤细胞转移的作用[18]。另有研究报道,vWF水平在淋巴瘤患者中明显升高,且与凝血因子Ⅷ水平相关[19]。本研究结果显示,与治疗前比较,患者治疗后血清ctDNA、miR-21、vWF水平明显降低,IL-17水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),提示vWF与DLBCL患者R-CHOP疗效有关;Logistic回归多因素分析发现血清vWF水平增高为DLBCL患者R-CHOP疗效的影响因素(P<0.05),说明血清vWF水平增高可能提示患者R-CHOP治疗无效风险,这与文献[20-21]报道结果相符,vWF水平已被证实在实体瘤中大幅度升高,并与肿瘤、分级及预后有关,vWF可能具有良好的临床预后价值。

淋巴瘤发生和疾病进展与染色体易位、细胞周期失控、细胞增殖异常、凋亡信号因子表达等相关[22]。既往研究显示,机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主,T淋巴细胞为重要的免疫细胞,而T淋巴细胞中的CD4+T细胞与DLBCL疾病关系密切[23]。IL-17为白介素家族重要成员之一,由CD4+T细胞分泌。有研究发现,IL-17在不同免疫状态、不同类型肿瘤中具有双向效应,一方面IL-17分子能抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤血管生成,阻止抗肿瘤反应,发挥其致癌特性,而另一方面IL-17分子可募集T淋巴细胞,增强自然杀伤细胞活性,抑制肿瘤转移,进而发挥其抑癌特性[24]。本研究结果显示,DLBCL患者经R-CHOP治疗后的血清IL-17水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),IL-17降低的DLBCL患者其R-CHOP疗效较差(P<0.05),许昕等[25]研究中亦提到DLBCL患者血清IL-17水平与健康人相比显著下降,且随着临床治疗无效,其低水平状态更为加剧,提示DLBCL中可能发挥抑癌特性。

本研究绘制ROC曲线发现,血清ctDNA、miR-21、IL-17、vWF联合预测DLBCL患者R-CHOP疗效的效能(AUC=0.821)要高于各指标单独应用时(AUC=0.706、0.652、0.638、0.677),其预测灵敏度与特异度依次为66.72%、92.32%,截断值依次为102.9 ng/mL、1.59、8.51 pg/mL、9.61 μg/mL,提示血清ctDNA、miR-21、IL-17、vWF联合监测可能有助于早期判断DLBCL患者R-CHOP疗效,筛选出对初始R-CHOP化疗反应欠佳者,及时调整治疗方案,进一步改善患者预后。目前,PET/CT在DLBCL中的预后评估意义基本被认可,但PET/CT的结果判读标准及检查的最佳时机仍具有较多争议,且PET/CT有一定辐射暴露风险,检查费较高,亦具有不可忽视的高假阳性率[26],而血清ctDNA、miR-21、IL-17、vWF检测属于微创,可连续多次采样,没有辐射暴露,可能更具潜在的临床应用优势。

综上所述,血清ctDNA、miR-21、vWF增高及IL-17降低的DLBCL患者其R-CHOP疗效较差,4个指标对DLBCL患者R-CHOP疗效有一定预测价值,有望成为DLBCL疗效评估的潜在标志物。但目前相关研究尚处在早期探索环节,仍需更多前瞻性、大样本、多中心研究加以论证。