基于隶属函数法对甘蓝型油菜种质苗期耐低氮胁迫能力的综合评价

陈敬东　余忆　鲁金春子　戴希刚　沈金雄　傅廷栋　伍晓明　曾长立　万何平

摘要：油菜作为我国重要的油料作物，其生长发育过程中对氮素营养需求量较大，但氮肥利用率却较低，在很大程度上制约了油菜的正常生长。探究苗期甘蓝型油菜耐低氮胁迫能力的评价方法，筛选耐低氮胁迫能力强的种质，可以减少氮肥施用量，保护生态环境。以49份甘蓝型油菜种质材料通过水培试验，考察低氮水平（0.3 mmol/L）和正常氮水平（6.0 mmol/L）的地上部鲜质量、地下部鲜质量、地上部干质量、地下部干质量、叶片数、株高、总根长、根平均直径、侧根数等性状，以各性状的耐低氮系数为衡量油菜耐低氮胁迫能力的指标，利用隶属函数法对不同基因型油菜进行耐低氮胁迫能力的综合评价，筛选出低氮胁迫耐受型材料8个，低氮胁迫敏感型材料14个，低氮胁迫中间型材料27个。D值与地上部鲜质量、地下部鲜质量、地上部干质量、地下部干质量、叶片数、株高、总根长和侧根数呈显著正相关，可作为油菜苗期耐低氮胁迫能力鉴定的辅助指标，对探究油菜耐低氮胁迫遗传机制，选育耐低氮胁迫油菜新种质具有重要意义。

关键词：甘蓝型油菜；耐低氮胁迫能力；隶属函数法；苗期；氮肥利用率

中图分类号：S634.301文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）14-0124-10

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）因产量较高、适应能力较强，在我国油菜种植面积中占比达到80%左右［1］。2017年我国自产植物油占植物油消费总量的30.8%，国产油料难以满足国民生产消费需求，供需不平衡的现象与日俱增［2］。因此，选育优质油菜种质，提高油料自给率，对保证我国油料安全具有重要意义。在油菜生长发育过程中，氮（N）作为大量元素，对于其产量、品质具有重要影响［3］。油菜处于苗期时，充足的氮素营养保证了其正常的生长发育，但在生产实践过程中，成熟期却常常因过量施用氮肥，导致油菜大量吸收氮素营养，造成其体内营养元素平衡性被破坏，反而抑制了油菜的正常生长［4］。与其他作物相比，油菜对氮素营养需求量相对较大，然而其氮肥利用效率却相对较低，生产者需要大量施用氮肥以保证其产量［5］。同时，过量施用氮肥会使盈余的氮素营养通过多种途径流失，从而可能导致一系列的环境问题［6］。除作为油料作物外，油菜已开发出饲用、菜用、观赏等多种用途。江西婺源、山西汉中等地以油菜花海为依托，打造了一批享誉全国的农业观光旅游景区，为推动当地经济社会发展提供了新动力［7］。因此，须要筛选出一批耐低氮胁迫能力强、适应性广的油菜品种（品系），以节约成本、保护生态环境。

作物的耐低氮胁迫能力是一个复杂的数量遗传性状，可能受到多种功能基因的共同调控，且对环境因子的变化十分敏感，难以直接评价［8］。目前，关于油菜低氮胁迫耐受种质和耐低氮胁迫机理研究已经取得了一些进展。研究者们通过选择低氮耐受的种质进一步改良油菜氮效率（NUE）。Miersch等研究结果表明，半矮秆杂交种在多种条件下都表现出更高的氮收获指数和氮利用效率，且通过试验确定其在低氮条件下为氮高效基因型［9］。邹小云等通过对抽薹期不同氮效率油菜的各性状进行分析，发现油菜抽薹期氮素吸收效率由根平均直径、最大叶长和叶宽的乘积、叶片的蒸腾速率以及油菜根系硝酸还原酶的活性共同决定［10］。Wang等发现在高氮和低氮2种条件下，根系形态（RM）良好或氮吸收效率（NupE）较高的种质，其NUE也相对较高，且RM对NUE的影响比NupE对NUE的影响更加明显［11］。上述研究通常比较多个农艺性状，并从中筛选出某项效应最大的单一指标从而评价油菜种质耐低氮胁迫能力，然而油菜的耐低氮胁迫能力是一个复杂的性状，不同低氮耐受型材料的耐性机制也不尽相同，利用单一指标筛选耐受材料的方法具有一定的局限性，其鉴定结果的有效性尚需进一步试验验证。而主成分分析法可以准确地计算多个指标所占权重，并从多个具有一定相关性的指标中计算出新的综合变量，具有较好的准确性。本研究在前人基础上，利用正常氮（6.0 mmol/L）和低氮（0.3 mmol/L）2种氮素营养水平，通过对49份油菜材料9个指标的耐低氮胁迫能力的综合评价，分析比较了综合指标与油菜苗期生物量之间的关系，以验证低氮耐受指标的准确性，并对各指标进行评价，确定了油菜耐低氮能力评价的适宜指标，筛选获得了一批低氮耐受材料，以期为油菜耐低氮品种选育提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甘蓝型油菜自交系材料共49份（表1），均由华中农业大学国家油菜工程技术研究中心提供，49份油菜资源主要来自于湖北、湖南、四川、重庆等省（市），前期研究结果表明，该群體材料具有广泛的遗传变异［12］。供试材料在2020年10月11日播种于湖北省武汉市蔡甸区江汉大学油菜种质资源试验区内。

1.2 试验设计与处理

为了探索能维持油菜最低生长要求的氮素营养水平，随机挑选5个油菜材料，利用油菜水培方法培养至4叶期进行不同浓度氮营养处理（N浓度：0.1、0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L）。根据结果，选取0.3 mmol/L浓度为低氮胁迫浓度，6.0 mmol/L浓度为正常氮营养水平。为精确考察49份油菜资源的耐低氮能力，Zeng等前期建立了一套大规模油菜水培系统［13］，可以同时培养超过 6 000 株油菜幼苗。在49份油菜自交系中每个基因型选出30粒种子进行发芽处理，再从中选出10株长势相似的健康幼苗，移入水培系统中培养4周［12］。每周更换1次培养液，4周培养液分别为0.25×霍格兰溶液、0.5×霍格兰溶液、1×霍格兰溶液和1×霍格兰溶液。从第5周开始，将同种基因型10株幼苗均分为2组，分别以正常氮（H）水平（6.0 mmol/L）和低氮（L）水平（0.3 mmol/L）对油菜进行处理，营养液配方见表2。配方中，调节KNO3和 Ca（NO3）2 浓度控制正常氮营养液和低氮营养液的氮含量，因KNO3和Ca（NO3）2浓度导致的K+和Ca2+含量的改变则利用KCl和CaCl2补足。以后每7 d为2种条件更换1次培养液，培养6周后收获并进行表型精准鉴定。本次利用无重复随机区组设计试验。

1.3 表型鉴定

材料收获后分成地上部（S）、地下部（R），考察其叶片数（LN）、株高（SL）、鲜质量（SW、RW）。取地下部根系，去除表面杂质后用去离子水多次冲洗，用爱普生扫描仪（Perfection V850 Pro）对甘蓝型油菜根系进行扫描，通过根系形态分析软件（WinRHIZO）分析获得总根长（RL）、根平均直径（RAD）、侧根数（RT）等油菜根系形态指标。地上部干质量（DSW）和地下部干质量（DRW）采用 105 ℃ 杀青30 min后，80 ℃烘干至恒质量测定其数值。

1.4 指标计算及数据分析

低氮胁迫耐受指数：为了排除因基因型背景差异而对试验结果可能造成的影响，选择计算油菜9个表型性状的低氮胁迫耐受指数（ LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW、LNT-LN、LNT-SL、LNT-RL、LNT-RAD和LNT-RT，LNT为低氮条件下的表型性状数值与正常氮条件下表型性状数值之间的比值）［12］。

2 结果与分析

2.1 油菜幼苗在不同浓度氮营养水平下的表现

由图1可知，不同氮营养水平下油菜幼苗的长势呈现明显的变化。其中高氮水平下，油菜生长正常，叶片颜色呈绿色，而随着氮浓度的降低，油菜生长会因为氮素营养的逐渐缺乏，而受到不同程度的抑制，具体表现为叶片变小、颜色变黄，出现紫色叶片。在低氮浓度下，油菜幼苗生长极其缓慢。低氮水平对不同油菜品种的抑制效果存在一定的差异，说明不同基因型油菜的耐低氮能力不同。综合考虑，选取0.3 mmol/L浓度为低氮胁迫浓度，6.0 mmol/L 浓度为正常氮营养水平。

2.2 不同氮水平条件下49份甘蓝型油菜材料表型分析及相关性分析

由表3可知，在正常氮条件下，甘蓝型油菜植株的SW平均值为21.45 g，变动范围为7.36～41.97 g，变异系数（CV）为31.80%；RW的平均值为3.19 g，变动范围为0.70～9.53 g，CV为45.98%；DSW的平均值为1.492 g，变动范围为0.483～2.797 g，CV为34.68%；DRW的平均值为0.256 g，变动范围为0.057～1.275 g，CV为71.07%；LN的平均值为8张，变动范围为6～17张，CV为23.85%；SL的平均值为38.8 cm，变动范围为 23.0～53.5 cm，CV为14.08%；RL的平均值为 1 205.31 cm，变动范围为690.25～2 011.97 cm，CV为24.75%；RAD的平均值为0.360 mm，变动范围为0.247～0.469 mm，CV为15.79%；RT的平均值为1 799条，变动范围为911～3 456条，CV为36.33%。在低氮条件下，甘蓝型油菜植株的SW平均值为6.52 g，变动范围为2.63～14.10 g，CV为37.64%；RW的平均值为1.64 g，变动范围为 0.49～3.23 g，CV为36.71%；DSW的平均值为0.814 g，变动范围为0.314～1.780 g，CV为 35.13%；DRW的平均值为0.147 g，变动范围为0.040～0.286 g，CV为37.11%；LN的平均值为5张，变动范围为3～8张，CV为17.94%；SL的平均值为19.3 cm，变动范围为13.7～25.0 cm，CV为16.00%；RL的平均值为1 532.95 cm，变动范围为779.80～2 406.58 cm，CV为23.48%；RAD的平均值为0.263 mm，变动范围为0.206～0.378 mm，CV为12.92%；RT的平均值为2 946条，变动范围为 1 423～5 763条，CV为37.59%。SW、RW、DSW、DRW、LN、SL和RAD在低氮条件下的表型数值都极显著低于正常氮条件下的表型数值，而RL和RT在低氮条件下的表型数值都极显著高于正常氮条件下的表型数值。在6.0 mmol/L和0.3 mmol/L 2种氮浓度下，9个农艺性状都呈现出正态分布的趋势（图2），表明这些性状可能均为数量性状。

9个低氮胁迫耐受指数（LNT）均表现出较大的遗传变异，LNT-SW的平均值为0.314，变动范围为0.180～0.587，CV为31.80%；LNT-RW的平均值为0.559，变动范围为0.205～0.963，CV为30.62%；LNT-DSW的平均值为0.561，变动范围为0.283～0.963，CV为25.58%；LNT-DRW的平均值为0.645，变动范围为0.215～0.981，CV为27.91%；LNT-LN的平均值为0.694，变动范围为0.456～0.882，CV为12.11%；LNT-SL的平均值为0.503，变动范围为0.365～0.703，CV为15.38%；LNT-RL的平均值为1.295，变动范围为1.008～1.864，CV為18.15%；LNT-RAD的平均值为0.746，变动范围为0.538～0.998，CV为18.23%；LNT-RT的平均值为1.704，变动范围为1.008～3.470，CV为31.56%。结果表明，低氮胁迫条件对不同基因型油菜的SW、RW、DSW、DRW、LN、SL和RAD存在显著的抑制效果，其中SW受影响最大。同时，低氮胁迫条件也会显著促进RL和RT。此外，9个低氮胁迫耐受指数都有正态分布的特点（图2）。

相关性分析结果（图3）显示，各性状的低氮胁迫耐受指数之间还存在着一定的关联性，这导致各指标所蕴含的信息可能存在交叉重复，且各性状在油菜低氮胁迫耐受能力中发挥的作用也不完全一致，因此，直接以低氮胁迫耐受指数评价油菜品种耐低氮胁迫能力的方法是不准确的。

2.3 主成分分析

利用SPSS 24软件对9个低氮胁迫耐受指数进行主成分分析（表4），前4个主成分（综合指标CI1、CI2、CI3、CI4）的贡献率分别达到了34.46%、16.30%、13.88%、10.57%，累计贡献率合计为75.21%，其他可忽略。这样就将原本9个低氮胁迫耐受指数转化为了4个相互独立的综合指标。决定第1综合指标大小的低氮胁迫耐受指数主要是SW、DSW、RW、RAD和DRW，可描述为生物量因子、根系形态因子；决定第2综合指标大小的主要是RL和RT，可描述为根系形态因子；决定第3综合指标大小的主要是SL和RAD，可描述为植株形态因子、根系形态因子；决定第4综合指标大小的主要是LN，可描述为植株形态因子。

2.4 油菜耐低氮胁迫能力的综合评价和聚类分析

利用公式计算不同基因型油菜所有综合指标的隶属函数、权重和耐低氮胁迫能力综合评价D值（表5）。以D值作为衡量不同基因型油菜耐低氮胁迫能力的强弱，其中材料30（Jia931）和23（Huayou3）的D值较大，具有较强的耐低氮胁迫能力。

采用欧氏距离（euclidean metric）和最大距离法（max distance）对D值进行聚类分析（图4），将49个基因型根据耐低氮胁迫能力分为3类，以综合衡量不同甘蓝型油菜种质的耐低氮胁迫能力。其中8份材料被划分为低氮胁迫耐受型种质（表6），其D值均大于0.6；14份材料被划分为低氮胁迫敏感型种质，其D值均小于0.4；其他27份材料则被划分为低氮胁迫中间型种质，其D值处于0.4～0.6之间。

2.5 线性回归预测油菜耐低氮胁迫能力

主成分分析结果表明，生物量因子和根系形态因子中RAD的贡献率相对较高。因此以LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW和LNT-RAD作为自变量，以D值作为因变量，建立回归方程：D=0.103+0.277x1+0.136x2+0.485x3+0.064x4-0.155x5（F=21.483**，R2=0.714）。该方程展示出5个低氮胁迫耐受指数和D值之间的显著线性关系，简化了性状鉴定工作。与基于单一性状的评价方法相比，该方法准确性高、筛选效率好。

3 讨论与结论

3.1 讨论

作物的耐低氮胁迫能力被广泛认为是受多基因调控的数量性状，每个相关的功能基因所发挥的作用可能相对微小；且功能基因与环境因子的互作会直接影响作物耐低氮胁迫能力的表现，这使得耐低氮胁迫能力性状不稳定，可能受到各种因素的影响［15］。因此，选择正确的耐低氮胁迫能力评价方法是最终准确衡量作物耐低氮胁迫能力的关键。对于评价油菜耐低氮胁迫能力的指标，目前较为常用的有产量、生物量和根系形态等［10，16-17］。或多或少存在着相关性的多个性状所提供的低氮耐受信息相互交叉重叠，展现出数量性状的特点。因此，利用常规鉴定方法通过单一指标来评价油菜的耐低氮胁迫能力，可能因基因型差异而造成植株对低氮胁迫的反应不尽相同，使得结果较为片面；且某个单一指标也可能與其他指标存在相互作用，使得结果准确性差，难以准确而全面地反映不同基因型耐低氮胁迫能力的强弱。需要通过测定多种指标去综合评价油菜的耐低氮胁迫能力，使得试验结果更加真实可靠。利用多元统计分析方法，即主成分分析法和隶属函数法，能够将不同的性状指标，转化成新的综合指标，其数目更少、相对独立性更强，可以较为全面地表现作物不同性状指标的全部信息，利用统计学方法计算出材料间的低氮耐受综合指标值和D值，从而准确且全面地反映出作物的耐低氮胁迫能力。

随着人们对农业生产实际中过量施用氮肥可能造成的环境问题的逐渐关注，如何在保证作物产量的前提下减少氮肥的使用越来越成为科研人员的研究热点。在低氮胁迫条件下选育氮高效即耐低氮胁迫能力强的品种（系），是解决这一问题的关键因素之一。目前，对水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等作物在低氮胁迫条件下的氮高效遗传机制及种质筛选方法已经有了大量的研究［18-22］。甘蓝型油菜不同基因型间耐低氮胁迫能力差异显著，具有广泛的遗传变异［23］。因此，选育耐低氮胁迫能力强的油菜种质以减少氮肥施用具有广阔的研究前景。邹小云等利用NupE差异较大的甘蓝型油菜种质湘油15和R210为亲本，以杂交和回交方法构建了6个世代，通过主基因配合多基因混合遗传模型，发现不同的氮素营养效率鉴定指标对应着不同的遗传模型，因而对种质氮素营养效率的改良也应该按照领域和目的的不同，选择最佳的氮素营养效率类别；他们也证明了通过不同氮效率油菜种质间的杂交和回交可以选育出氮高效的基因型［24］。张浩等在高氮和低氮2种营养条件下，以不同基因型油菜种质为材料，通过2年3点的田间试验，发现油菜具有较大的减氮增产增效潜力，且不同的基因型间潜力差异较大，他们还以产量均值为依据，将供试材料划分为不同氮效率的4种类型［25］。

利用主成分分析法和隶属函数法综合评价作物耐低氮胁迫能力的研究已经在谷子、玉米和小麦等作物中得到了初步应用［26-28］。秦璐等也利用该方法对甘蓝型油菜盛花期耐低氮胁迫能力进行了比较分析，但在苗期对甘蓝型油菜耐低氮胁迫能力鉴定的研究尚未见报道［29］。本研究以各性状的低氮胁迫耐受指数为标准评价油菜单一指标的耐低氮胁迫能力，利用主成分分析法将9个油菜农艺性状简化为了4个相互独立的综合指标。这种方法既能较为全面地反映原性状指标的信息，且更突显出了不同基因型油菜的性状差异。根据贡献率计算出各综合指标相应的隶属函数值，加权后即可得到不同基因型油菜耐低氮胁迫能力的综合评价值，即D值。进一步通过聚类分析，将49份油菜种质划分为3个类型，其中Jia931、Huayou3等8个材料被划分为低氮胁迫耐受型种质，Wanyou20、SWU74等14个材料被划分为低氮胁迫敏感型种质，Enyou73-1-2、B265等27个材料则被划分为低氮胁迫中间型种质。

作物抗逆性种质筛选是一项工作量巨大、时间成本较高的工作，如何在种质资源鉴定过程中，筛选出操作简单、结果可靠的鉴定指标对于作物抗逆育种具有重要意义。目前已经有许多与作物耐低氮胁迫能力相关的农艺和生理指标被应用于研究，生物量、根系形态、株高、叶片数等指标均对低氮胁迫有显著响应，可作为鉴定油菜耐低氮胁迫能力的指标［10，16-17，30］。本研究根据主成分分析结果，推测LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW和LNT-RAD这5个低氮胁迫耐受指数对油菜耐低氮胁迫能力可能具有较大的影响，因此以5个低氮胁迫耐受指数为自变量，以D值作为因变量进行了多元回归分析，发现这5个指标确实与D值之间存在显著线性关系，在一定程度上可以作为油菜苗期耐低氮胁迫能力的鉴定指标。

3.2 结论

本研究通过对49份油菜种质9个农艺性状的低氮胁迫耐受指数进行主成分分析，简化为了4个综合指标。利用隶属函数法计算出各材料的D值，并依据D值进行聚类，将49份油菜种质划分为3个类型，低氮胁迫耐受型种质8个，低氮胁迫敏感型种质14个，低氮胁迫中间型种质27个。通过多元线性回归，建立了以LNT-SW、LNT-RW、LNT-DSW、LNT-DRW和LNT-RAD计算不同基因型D值的回归方程，简化了油菜耐低氮胁迫能力鉴定的评价指标，使得鉴定过程更为迅速、简单，为进一步改良现有优质油菜种质的耐低氮胁迫能力提供了理论基础。本研究重点关注了低氮胁迫对油菜苗期农艺性状的影响，而尚未对生理性状进行研究。因此，后续有必要继续开展相关研究，筛选到可靠的耐低氮胁迫能力较强的油菜种质资源。

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收稿日期：2022-09-21

基金项目：国家重点研发计划（编号：2016YFD0100202-25）；湖北省汉江流域特色生物资源保护开发与利用工程技术研究中心开放基金（编号：06450003）。

作者简介：陈敬东（1995—），男，湖北红安人，硕士，从事作物遗传育种研究。E-mail：cjd19951226@126.com。

通信作者：曾长立，博士，教授，从事油菜种质资源研究，E-mail：zengchangli@jhun.edu.cn；万何平，博士，讲师，从事油菜遗传研究，E-mail：362057164@ qq.com。